气单胞属菌粪便分离株分子鉴定与耐药元件检测

翁幸鐾，糜祖煌，周铁丽

气单胞属菌粪便分离株分子鉴定与耐药元件检测

翁幸鐾1，2，糜祖煌3，周铁丽1

目的 调查一组14株气单胞属菌的菌种分子鉴定情况，以及β-内酰胺酶类、氨基糖苷类耐药的遗传学背景。方法 14株气单胞属菌均分离自2012年1月至12月宁波市第一医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本，再作通用引物16SrDNA测序比对判定菌种，然后用聚合酶链反应(PCR)的方法分析23种β-内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因以及6种可移动遗传元件分子标记。结果 本组14株菌经16SrDNA测序比对,10株为嗜水气单胞菌, 水簇箱气单胞菌、温和气单胞菌、肠棕气单胞菌、斑点气单胞菌各1株。14株气单胞菌共检出5种β-内酰胺酶基因、4种氨基糖苷类修饰酶基因和3种可移动遗传元件遗传标记基因。其中4号株(嗜水气单胞菌)AQU基因是新的基因亚型，命名为AQU-2, 11号株(水簇箱气单胞菌)AQU基因也是新的基因亚型，命名为AQU-3。结论 气单胞菌属的菌种鉴定应该以分子鉴定法为准。本组14株气单胞属菌耐药严重，已呈多重耐药。

气单胞属菌；分子鉴定；耐药基因；基因亚型；可移动遗传元件

气单胞属菌(Aeromonas)为革兰氏阴性短杆菌，属內已被命名的菌种已超过20种。气单胞属菌为条件致病菌，是典型的人—兽—魚共患病原菌。气单胞属菌可致宿主肠道疾病和肠外疾病。最近，我们从人粪便中分离到一组经仪器鉴定为气单胞属菌,为了确认菌种进一步作了16SrDNA测序比对(即菌种分子鉴定)。并进行了23种β-内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因以及6种可移动遗传元件分子标记检测,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 14株菌均为分离自宁波市第一医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本,经法国bioMerieux公司Vitek 2-Compact全自动微生物鉴定仪及配套革兰阴性菌鉴定卡进行菌株鉴定为气单胞属菌。

1.2 细菌分子鉴定 14株菌均作通用引物16SrDNA测序,测得序列上网比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)判定菌种。16SrDNA扩增与测序引物序列为:P1:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; P2:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′[1]。16SrDNA PCR试剂盒和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.3 药敏试验 采用法国生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自动微生物鉴定仪及配套革兰阴性菌药敏卡进行药物敏感性检测。再根据2014年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的标准进行抗菌药物敏感性判断。

1.4 细菌基因检测模板处理 挑取单个菌落，置入0.5 mL的eppendorf离心管(管内预置浓度为200 μg/L的蛋白酶K溶液400 μL),加盖后放置56 ℃水浴2 h,然后放置95 ℃水浴10 min。基因检测模板即完成,模板液放置-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 基因检测 23种β-内酰胺酶基因(包括A类、C类、D类β-内酰胺酶基因, B类β-内酰胺酶基因因本组菌株无碳青霉烯类药物耐药株故未作检测)、6种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因以及6种可移动遗传元件分子标记检测均为PCR法。PCR靶基因引物识别序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为:每反应体系P1引物1 μL(1.0 μmol/L)、P2引物1 μL(1.0 μmol/L),dNTPs 2 μL(2 mmol/L), 10倍缓冲液2 μL(KCl 10 mmol/L,(NH4)2SO48 mmol/L，MgCl22 mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10 mmol/L，NP400.5%，BSA 0.02%(wt/vol))，Taq DNA pol 1U(不计体积),超纯水9 μL, 模板液5 μL,总反应体积20 μL。PCR扩增产物>500 bp热循环参数均为：93 ℃预变性2 min，然后93 ℃60 s→55 ℃60 s→72 ℃60 s，循环35周期，最后一个72 ℃延长至5 min,其余均为：93 ℃预变性2 min，然后93 ℃30 s→55 ℃30 s→72 ℃ 60 s，循环35周期，最后一个72 ℃延长至5 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。基因检测试剂盒和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供(PCR引物序列由无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌根据2013年2月1日之前已在www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide登录的各种序列的保守区域完成设计,并获授权使用)。

表1 靶基因引物识别序列和目的产物长度

表1(续表1)

表1(续表2)

1.6 阳性基因测序 PCR阳性产物为PCR直接全自动荧光法测序,委托上海博尚生物技术有限公司完成(测序在美国ABI公司3730型毛细管全自动测序仪上进行)。

1.7 测得序列比对 读序工具软件为Chromas,测序结果用Chromas直接作BLAST Search比对, 或拼接成全长序列后作BLASTn比对。

2 结 果

2.1 菌株分子鉴定结果 本组14株菌经16SrDNA测序上网比对,10株为嗜水气单胞菌(A.hydrophila),另外水簇箱气单胞菌(A.aquariorum)、温和气单胞菌(A.sobria)、肠棕气单胞菌(A.enteropelogenes)、斑点气单胞菌(A.punctata)各1株。14株气单胞属菌进一步作药敏检测和耐药检测。

2.2 药敏试验结果 14株气单胞属菌对抗菌药物的药敏试验结果见表2。

2.3 耐药元件检测结果 14株气单胞属菌耐药元件检测结果与部分β-内酰胺类、氨基糖苷类药物药敏结果见表3,表4为14株气单胞属菌耐药元件检测结果，共检出5种β-内酰胺酶基因、4种氨基糖苷类修饰酶基因和3种可移动遗传元件遗传标记基因。其中4号株(嗜水气单胞菌)AQU基因测得1 143 bp与美国GenBank已登录的AQU序列不同,被命名为AQU-2正在登录美国GenBank,其中11号株(水簇箱气单胞菌)AQU基因测得1149 bp亦与美国GenBank已登录的AQU序列不同,被命名为AQU-3正在登录美国GenBank。2号株(嗜水气单胞菌)、3号株(嗜水气单胞菌)、5号株(嗜水气单胞菌)的aac(6’)-Ⅰb-cr序列亦正登录美国GenBank。

3 讨 论

在水产养殖领域,国内魚、蟹、鱉疾病与气单胞菌感染的关系研究颇多。

在临床医学领域，国内主要为气单胞菌感染导致腹泻的个案报道。进入本世纪后有几起气单胞菌感染导致群体性腹泻的报道[2-3]，和气单胞菌致急性白血病患者皮肤软组织感染[4]和肝硬化患者败血症的个案报道[5]。除此之外，国外还报道了气单胞菌导致的多种肠外感染，如伤口感染、尿路感染、肝胆道感染,软组织感染、脑膜炎[6]，免疫缺陷儿童可引起更严重的溶血性尿毒综合征(HUS)、坏死性筋膜炎[7]。

但气单胞菌属的菌种鉴定，常规的生化鉴定法准确率不高，应该以分子鉴定法为准。本文仪器判读为气单胞菌的14株菌,经16SrDNA测序比对,10株为嗜水气单胞菌, 另外水簇箱气单胞菌、温和气单胞菌、肠棕气单胞菌、斑点气单胞菌各1株。

表2 14株气单胞属菌对抗菌药物的药敏试验结果(%)

表3 14株气单胞菌属耐药元件检测结果与部分β-内酰胺类、氨基糖苷类药物药敏结果

注：本组1-10号菌为A.hy：嗜水气单胞菌，11号菌为A.aq：水簇箱气单胞菌、12号菌为A.so：温和气单胞菌、13号菌为A.en：肠棕气单胞菌、14号菌为A.pu：斑点气单胞菌。因9、10、13、14号菌未检出上述阳性基因，故未列出。未检出阳性基因的项目亦未列出。

Cefatriaxone：头孢曲松、Gentamycin：庆大霉素、Amikacin：阿米卡星、R：耐药、S：敏感。

Note:The items of negative genes are not listed.

表4 14株气单胞属菌耐药元件检测结果汇总

Note:The items of negative genes are not listed.

国外的相关研究也证实了这点。Aravena-Román M等对104株生化鉴定为嗜水气单胞菌，用分子鉴定法(rpoD+gyrB)再次鉴定，发现符合率只有33.6%(35/104)，其它分别为气单胞菌属其它菌种[8]。Figueras MJ等对150株生化鉴定为气单胞菌属细菌，用16S rDNA-RFLP法重新鉴定，138株(92%)证实为气单胞菌属各个种，仍有24株(17.5%)还是无法鉴定，继续用rpoD+gyrB法鉴定到种[9]。Martínez-Murcia AJ等从水体和进口观赏鱼皮肤分离到48株气单胞菌属细菌，用常规生化法无法鉴定到种，他们联用gyrB+rpoD法、16S rRNA法、DNA-DNA杂交法、MALDI-TOF MS法、RAPD基因分型法来鉴定菌种[10]。

从表2可见，本组14株气单胞属菌耐药严重，已呈多重耐药。气单胞属菌特有的AQU基因是染色体介导的C类β-内酰胺酶编码基因(AmpC酶编码基因)，最近由台湾研究人员在达卡气单胞菌(Aeromonasdhakensis)、嗜水气单胞菌、水簇箱气单胞菌中检测到，可介导头孢噻肟耐药[11]。本组4号株(嗜水气单胞菌)检出了AQU-2，11号株(水簇箱气单胞菌)检出了AQU-3。另一种气单胞属菌特有的CepS/CepH基因在本组菌中未检出。国内在临床医学领域尚无对分离株进行分子鉴定对菌株“验明正身”,然后进行23种β-内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因以及6种可移动遗传元件分子标记检测的报道。

如表3所示，检出β-内酰胺酶基因的菌株对β-内酰胺类抗生素表现为不同程度的耐药；5号、10号、13号这3株菌，未检出β-内酰胺酶基因，因此对β-内酰胺类敏感。但6号、9号、14号这3株β-内酰胺酶基因阴性的菌株，对β-内酰胺类耐药，推测可能存在新的β-内酰胺酶基因。氨基糖苷类的基因型和表型对应较好。

气单胞菌属细菌也携带了大量的毒力因子，包括溶血素、细胞兴奋素、细胞毒性肠毒素、蛋白酶、脂酶、杀白细胞素、内毒素、粘附素和S层[12]。这些毒力因子和致病力的相关性值得我们做进一步深入研究。

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Molecular identification and resistant derterminants ofAeromonassp. isolated from stool of human

WENG Xing-bei1,2,MI Zu-huang3,ZHOU Tie-li1

(1.WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.MedicalLaboratoryDepartment,NingboFirstHospital,Ningbo315010,China;3.WuxiCloneGen-TechInstitute,Wuxi214026,China)

We investigated molecular identification of a group of 14 strains ofAeromonassp., and genetic background of resistance to beta-lactams, aminoglycosides. From January to December 2012, 14 strains ofAeromonassp. were collected from stool from diarrheal patients in enteric clinics in Ningbo First Hospital in Zhejiang Province, China. Then, molecular identification by 16SrDNA, 23 kinds of beta-lactamase genes, 6 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes, 6 kinds of 16srRNA methylase genes, and 6 kinds of mobile genetic elements were analyzed by PCR. In addition, genotyping and sample cluster analysis were performed. Results showed that 10 strains ofA.hydrophila, 1 strain ofA.aquariorum,A.sobria,A.enteropelogenes,A.punctatawere confirmed by 16SrDNA sequencing and arithmetic. Five kinds of beta-lactamase genes, 4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes, and 3 kinds of mobile genetic elements were positive.BlaAQU of strain No.4(AQU-2) and strain No.11(AQU-3) were new subtypes. It’s suggested that identification ofAeromonassp. should be performed by molecular identification method. This group of 14 strains ofAeromonassp. conferred multidrug resistance.

Aeromonas; molecular identification; resistant determinant; subtype; mobile genetic element

Zhou Tie-li, Email:wyztli@163.com

周铁丽，Email：wyztli@163.com

1.温州医科大学，温州 325035； 2.宁波市第一医院检验科，宁波 315010； 3.无锡市克隆遗传技术研究所，无锡 214026

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.008

R378.2

A

1002-2694(2015)10-0931-07

2015-01-21；

2015-08-11

浙江省中医药基金(2011ZB126),宁波市自然科学基金(2012A610186)

Supported by the Traditional Chinese Medicine Foundation of Zhejiang Province (No. 2011ZB126), the Ningbo Natural Science Foundation (No. 2012A610186)