全自动酶联免疫分析仪检测乙肝核心抗体的加样质量控制*

张 龙，银广悦，武彩虹，王 辉，张朝云(中国石油中心医院：.检验科;.急诊科;.内分泌科, 河北廊坊 065000)



·论 著·

全自动酶联免疫分析仪检测乙肝核心抗体的加样质量控制*

张 龙1，银广悦1，武彩虹1，王 辉2，张朝云3(中国石油中心医院：1.检验科;2.急诊科;3.内分泌科, 河北廊坊 065000)

目的 选择TECAN全自动酶联免疫分析仪检测乙肝核心抗体(HBcAb)的理想检测程序。方法 对同一样本设置不同的加样方式、加样顺序，获得相应的数据，比较检测结果以确定理想检测程序。结果 TECAN全自动酶联免疫分析仪检测HBcAb，加样针存在拖带现象，可能造成标本污染，出现假阳性结果，或污染阴性对照，使CO值降低，造成假阴性结果。通过改进加样程序，减少携带概率，避免阴性对照污染，提高检测质量。结论 用单独加样方式，先加阴阳对照再加标本的顺序为理想的检测程序。

乙肝核心抗体； 全自动酶联免疫分析仪； 质量控制

乙肝核心抗原(HBcAg)的强抗原性使接触过或感染乙肝的人群产生大量的乙肝核心抗体(HBcAb)，HBcAb阳性提示此人有过乙肝(HBV)接触史。TECAN全自动酶联免疫分析仪可以完全代替手工，具有加样准、速度快等优点，但目前仪器加样系统大多采用的是非一次性的Teflon涂层钢针，当遇到强阳性标本时，由于加样针未能进行彻底洗涤，导致了后一孔甚至多孔加样拖带阳性现象，甚至污染后面标本，使之出现假阳性结果[1-3]。目前样本拖带污染问题日益受到广泛关注。本研究旨在改进TECAN全自动酶联免疫分析仪的加样程序，提高HBcAb的检测质量[4]。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取2014年4月中国石油中心医院乙肝患者血清20份，HBcAb为强阳性，OD值在0～0.001之间，每份标本后面对应的同一根针加样标本OD值偏低，怀疑有加样针携带污染情况，标本无溶血、无脂血、无黄疸，每份标本不少于2 mL，阴性标本使用试剂自带阴性对照，批号相同。

1.2 仪器与试剂 TECAN全自动酶联免疫分析仪，型号DK-1504。乙肝病毒表面抗原ELISA诊断试剂盒(英科新创，批号2013075509)。

1.3 方法 将收集的阳性标本制作成混合血清，分成7组，定为P组，每组4个；试验所用的阴性对照批号相同，编为A1组、A2组、B1组、B2组。具体方法如下：(1)方法A为仪器标本位上1～4号为试剂自带阴性对照组(A1组)，5～8号为P组标本，9～12号为试剂自带阴性对照组(A2组)，13～16号位放P组标本，17～20号为试验组A2，21～23号位分别为阳性对照、阴性对照、空白孔。(2)方法B为仪器标本位上1～4号试剂自带阴性对照B1组作为对照组，5～8号位放P组标本,9～12号为试剂自带阴性对照B2组作为试验组，13～16号位放P组标本，17～20号位不放标本，在加样时将B2组倒过来，21～24号位放P组标本，25～28号位不编标本，在加样时再将B2组倒过来，29～31号位分别为阳性对照，阴性对照，空白孔。2次试验均模拟日常乙肝5项检验，先将稀释液(生理盐水)290 μL加入HBcAb试剂微孔板中，加10 μL血清进行1∶30倍稀释，并与其余4项同时加样，即吸一次血清5项全加完，然后再从HBcAb试剂微孔中吸出250 μL已稀释血清，剩余50 μL。(3)方法C为标本编排同方法A，试验顺序变为HBcAb单独加样，其他4项同时加样，且阴阳对照提至加标本之前。

2 结 果

2.1 方法A 观察加样针的携带现象，所用酶联免疫分析仪有4根针，1～4号标本作为对照组，后面每4个阳性标本后跟着4个阴性对照作为试验组，结果均值为2.192，结果明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 方法B 观察加样针的污染现象，1～4号作为对照组，后面每加1次阳性对照，加样针接触1次阴性对照，共接触3次，结果均值为1.741，明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 3种方法试验结果对比 方法C作为纠正后加样方案，阴性对照组结果没有明显变化。方法A评价单次吸样阳性标本对后面标本或阴性对照的污染和拖带现象。方法B是多次吸样阳性标本，多次接触阴性对照，是对阴性对的污染情况评价。方法C与前两次试验作比较，评价调整加样程序对结果的影响。见表1。

表1 3种方法试验结果对比表(OD)

注：与对照组比较，△P<0.05。

3 讨 论

HBcAb是病毒刺激肝细胞产生的一种免疫球蛋白,它是感染病毒后最早呈阳性,也是最晚转阴性的一项，其阳性不仅代表乙肝接触史，也可能是隐性乙肝病毒感染后的一种表现，由于HBcAb并不作为诊断指标，往往HBcAb阳性标本不被复查，一直以来HBcAb的阴性对照稳定性很差，尤其是不及时更换阴性对照情况下，时常阴性对照OD值明显下降，而此OD值直接用来计算CO值，其结果对于HBcAb滴度低的标本造成假阴性结果。

HBcAg的强抗原性，使既往接触史人群或乙肝患者人群产生大量的HBcAb，而且目前试剂的灵敏度能达到纳克水平，很可能造成全自动酶免疫的加样携带现象，已有文献报道加样针污染标本的情况。虽然酶联免疫分析仪加样针有特殊涂层，能有效地防止挂液现象，但大多医院只用去离子水清洗钢针，一旦遇到高滴度标本或高黏度样本时，加样针往往不能冲洗干净，从而造成携带现象[5]。仪器在加样过程中，为了加样量的准确，吸样完成后再吐出部分标本，并且随着钢针被重复使用次数的增加，其内壁可能吸附蛋白质或脂质等污物，这样携带的残留直接污染下一标本，方法A、方法B中的试验组标本明显已被污染，而且接触阳性标本次数越多污染越严重[6-7]。

综上所述，HBcAb在日常检测中的质量难以保证，以往，检测乙肝5项一般是5项平行加样，加样针内吸样至少235 μL，虽然加样针内部经过了特殊处理，单靠去离子水仍然难以彻底清洗干净；改变流程后，单加HBcAb，吸样10 μL就可以，很大程度减少了标本与加样针内部的接触面积，也就减少了残留，降低了加样针携带概率。阴阳对照调整为先加，这样可以避免加样针对阴性对照的污染，确保CO值的准确、稳定，由此，用TECAN全自动酶联免疫分析仪DK1504检测乙肝5项中的HBcAb，方法C是较为理想的工作程序。

[1] 柯苑，马成平，赵静.抗-HIV 抗体检测时出现拖带污染分析[J]．临床检验杂志，2004,22(6):480-481．

[2] 胡成义，刘洋．全自动酶免仪结果污染因素的分析[J]． 国际检验医学杂志，2006，27(10):940-943．

[3] 蒋国瑾．ELISA 法检测梅毒抗体拖带阳性现象分析[J]．浙江实用医学，2004，9(5):375-376．

[4] Armbruster DA，Alexander DB．Sample to sample carryover:a source of analytical laboratory error and its relevance to integrated clinical chemistry/immunoassay systems[J]．Clin Chim Acta,2006,373(1/2):37-43．

[5] 王平，陈忠.高黏度样品影响全自动生化分析仪加样系统的试验探讨[J].中华检验医学杂志,2003,26(4):216-218.

[6] 朱安友.全自动酶免分析仪加样中拖带阳性的解决方法探讨[J].蚌埠医学院学报，2010，35(8):817-818.

[7] 张悦，陈娟.ELISA 法检测抗-HIV 强阳性拖带现象分析[J].中国卫生检验杂志，2005，15(6):750-752.

Quality control of adding sample on HBcAb by automatic enzyme immunoassay instrument*

ZHANGLong1,YINGuang-yue1,WUCai-hong1,WANGHui2,ZHANGChao-yun3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofEmergency;3.DepartmentofEndocrinology,CentralHospitalofChinaNationalPetroleumCorporation,Langfang,Hebei065000,China)

Objective To select the ideal examination program of the TECAN automatic enzyme immunoassay instrument for detecting HBcAb.Methods The different adding modes and adding sequences were set on the same sample for obtaining the corresponding data. Results In detecting HBcAb by the TECAN automatic enzyme immunoassay instrument,adding sample needle had the entrainment phenomenon,which could cause the sample contamination,thus led to false positive results or contaminated the negative control to make the CO value decrease and cause the false negative result. The improvement of adding sample program reduced the carrying probability,avoided the negative control pollution and increased the detection quality.Conclusion Adopting the single adding sample mode,and first adding negative and positive control and then sample are the ideal detection program.

HBcAb; automatic enzyme immunoassay instrument; quality control

河北省廊坊市科技局项目(2013013020C)。

张龙，男，主管检验师，本科，主要从事医学检验质量控制方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.017

A

1672-9455(2015)16-2342-02

2015-01-25

2015-04-15)