外吐小体内microRNA-193b在阿尔茨海默病患者中的检测*

刘辰庚，张跃其，王金玲，王培昌(首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053)



·论 著·

外吐小体内microRNA-193b在阿尔茨海默病患者中的检测*

刘辰庚，张跃其，王金玲，王培昌△(首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053)

目的 初步探讨microRNA-193b(miR-193b)作为阿尔茨海默病(AD)生物标志物的潜在价值。方法 使用超速离心法提取痴呆期AD(DAT)患者和轻度认知障碍(MCI)患者和健康对照组血清和脑脊液外吐小体并检测其miR-193b水平。结果 MCI和DAT患者脑脊液及血清外吐小体内miR-193b水平均低于对照组(P<0.05)，且DAT组低于MCI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 脑脊液和血清外吐小体内miR-193b可能为AD，特别是早期诊断AD的标志物。

阿尔茨海默病； 外吐小体； 微小RNA； 生物标志物

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆症中最为重要和常见的类型[1]。研究表明外吐小体内microRNA(miR)有作为疾病生物标志物的价值，且可能参与了细胞间的信号传递。本研究在前期研究的提示下，使用实时定量PCR检测AD患者血清和脑脊液中外吐小体内和总体miR-193b的水平，初步探索外吐小体内miR-193b作为AD生物标志物的潜在价值[2]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月至2014年11月本院收治的AD患者共79例，其中轻度认知障碍期患者(MCI)43例，男25例，年龄中位数63岁；女18例，年龄中位数65岁。痴呆期患者(DAT)36例，男21例，年龄中位数72岁；女15例，年龄中位数75岁。MCI和DAT的诊断符合美国国立卫生研究院国立老化研究所和AD协会于2011年4月联合发布，并经我国神经内科学会推荐的诊断标准[3]。另随机选取性别、年龄匹配的健康者作为对照组。本研究内容已通过本院伦理委员会审核批准。

1.2 标本采集 受试者空腹12 h后分别使用肝素抗凝管和促凝管采集静脉血，抽血后1 h内以3 000 r/min离心7 min，分离血浆或血清。男性患者8例(3例MCI，5例DAT)抽血后1 h内由神经内科医生按照操作规程抽取脑脊液标本2 mL。标本在分析前保存于液氮中。

1.3 外吐小体提取 液氮中取出的标本分别置于-80、-20和4 ℃冰箱0.5 h缓慢复融，之后立即转入玻璃试管。使用预冷的磷酸盐(PBS)缓冲液将标本1∶1稀释，4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min；将上清转移至超速离心管中，避免混入沉淀以防止细胞碎片污染；之后4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min；小心吸出上清液，4 ℃条件下110 000 r/min离心1 h；弃上清液，加入5 mL预冷的PBS液并充分混匀；使用0.22 μm滤器过滤混合液；4 ℃条件下110 000 r/min离心30 min；弃上清液，加入5 mL预冷的PBS液，混匀后4 ℃条件下110 000 r/min离心30 min；弃上清液，加入100 μL预冷的PBS液重悬沉淀，即为外吐小体混合液[4]。

1.4 小RNA提取及miR-193b测定 使用天根公司(TIANGEN)miRcute miR亲和柱提取小RNA，按说明书操作。每100 μL外吐小体PBS溶液加入100 μL裂解液，纯化好的小RNA溶解于10 μL RNase-Free dd H2O 中；同时，提取脑脊液和血清标本中的总小RNA。20 μL逆转录体系中含RNA模板0.4 ng，RT Primer Mix 4 μL，5×RT Buffer 4 μL，RNase inhibitor 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，逆转录酶2 μL。20 μL miR检测体系中含miR cDNA 1.0 μL，2×SYBR Green Mix 10.0 μL，相应上、下游引物各0.5 μL。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，25 s；62 ℃，35 s；72 ℃，25 s，35个循环。以Ce_miR-39为内参，使用2-ΔΔCT法计算并统计miR-193b组间表达的差异[5]。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理及统计学分析，计量资料采用One-Way ANOVA分析，相同患者不同标本检测结果的组间比较使用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清、血浆标本相关性分析 同一受试者血清标本中总体miR-193b和外吐小体内miR-193b均略高于血浆，但差异无统计学意义(P>0.05)，其中对照4例，MCI 3例，DAT 3例；2种标本检测结果均有相关性(r2=0.987)。见图1。

注：1～4为对照组标本，5～7为MCI组标本，8～10为DAT组标本。

图1 同一受试者血清(A)和血浆(B)标本中总体miR- 193b和外吐小体内miR-193b的比较(n=10)

注：与对照组比较，*P<0.05；与MCI组比较，#P<0.05。

图2 MCI和DAT患者脑脊液总体miR-193b和 外吐小体内miR-193b水平检测

注：与对照组比较，*P<0.05；与MCI组比较，#P<0.05。

图3 MCI和DAT患者血清总体miR-193b和 外吐小体内miR-193b水平检测

2.2 脑脊液标本检测 MCI和DAT患者脑脊液总体miR-193b水平均低于对照组(P<0.05)，但MCI和DAT患者组间差异无统计学意义(P>0.05)；MCI和DAT患者脑脊液外吐小体内miR-193b水平均低于对照组，且DAT组低于MCI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 血清标本检测 MCI和DAT患者血清总体miR-193b水平与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，MCI和DAT患者组间差异亦无统计学意义(P>0.05)；MCI和DAT患者血清外吐小体内miR-193b水平均低于对照组，且DAT组低于MCI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

3 讨 论

随着研究的不断深入，miR在AD发生和发展中的作用被更多地揭示，越来越多的研究结果提示相关miR表达的失控可能在AD中扮演了重要角色。miR在疾病中的改变主要包括在转录水平表达的上调或下调；参与miR转录后加工相关因子的表达失控而导致的miR转录后表达的上调或下调；以及miR基因的突变等。随着芯片技术、高通量测序技术和实时荧光定量PCR技术的不断进步和检测成本的不断降低，已有越来越多的研究着眼于探索miR这一潜在的疾病标志物。目前已经发现并被miR Base数据库收录的人类miR分子已近2 000种，其中绝大部分的miR分子在不同病理和生理状况下都有表达，并且多数miR能够在人体液中检出[6-8]。

目前可能应用于AD诊断的标志物主要是蛋白类标志物，例如tau蛋白、p-tau蛋白、t-tau蛋白和BACE-1酶活性等，如前所述，这些蛋白在脑脊液中的阳性率和阴性率较为满意，但在血液标本中则不甚理想。虽然脑脊液的生化改变较好地反映脑组织病理生理改变，但由于血脑屏障的存在，能进入外周血的生物大分子的数量远少于其在脑脊液中的数量，使得丰度较低的脑源性标志物即使在血液中发生改变也难以被有效地检出。而对于AD患者，特别是pre-MCI和MCI患者而言，对其进行CSF检查往往得不到患者的理解，故寻找血液、尿液等更易获得的体液标本中的AD标志物尤为关键。循环miR具有作为生物标志物的几大优势：首先，它们在血液中能稳定地存在，离体后也能在血液标本中保存较长时间，且其受pH值、温度变化、反复冻融等影响较小[9]。其次，大多数miR在种属间较为保守，这使得大部分在动物模型上初步发现的潜在miR标志物在人体内也能被检测到。第三，以现在的分子生物学技术，大部分实验室均能较好地进行血液标本miR的分离和定量检测[10]。

困扰研究者的一大问题是miR的来源——相应miR的改变是不是疾病特异性的，是否受到健康组织正常代谢的影响。另外，目前认为体液中的miR除和一些蛋白结合而免于被降解之外，还能存在于外吐小体和微囊泡中。有学者甚至认为，细胞就是以外吐小体和微囊泡形式对外分泌miR，这些外吐小体和微囊泡可能包含了分泌细胞要传达给外界的信息[11]。事实上，Benner[12]早在1988年就曾提出“细胞外通讯RNA”假说，并认为细胞外RNA在细胞增殖和分化中起重要作用。已有研究证实组成血脑屏障的内皮细胞能分泌微囊泡，但其是否能分泌外吐小体目前尚未见报道[13-14]。本研究结果提示，miR-193b在血清中的存在形式可能有2种——外吐小体内和外吐小体外，且miR-193b在脑脊液和外周血之间的转移很可能主要以外吐小体为载体；换言之，组成血脑屏障的内皮细胞也能够分泌外吐小体，这种含有不同浓度miR的外吐小体很可能包含了脑组织向外周组织所传递的信息。

本研究结果表明，MCI和DAT患者血清总体miR-193b的检测结果与健康对照组差异无统计学意义，而当提取外吐小体检测后发现，外吐小体内的miR-193b在MCI和DAT患者中均出现了明显变化，且MCI患者血清外吐小体内miR-193b明显低于DAT患者，提示外吐小体内miR-193b可能有助于AD的诊断，特别是早期诊断。结合脑脊液检测结果，不难发现血清外吐小体内miR-193b的降低的原因之一可能是脑脊液向外周血分泌的外吐小体内miR-193b水平的降低。

综上所述，血清外吐小体内miR-193b可能为AD，特别是早期诊断AD的标志物。

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Detection of exosomal microRNA-193b in patients of Alzheimer′s disease*

LIUChen-geng,ZHANGYue-qi,WANGJin-ling,WANGPei-chang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China)

Objective To evaluate the potential value of microRNA-193b(miR-193b) as a biomarker in Alzheimer′s disease(AD).Methods The super centrifugation method was adopted to extract the exosome from serum and cerebrospinal fluid and the level of exosomal miR-193b was detected in the patients with mild cognitive impairment(MCI),patients with dementia of Alzheimer′s type(DAT) and healthy control group.Results The exosomal miR-193b levels in cerebrospinal fluid of the patients with MCI and DAT were significantly higher than that of the control(P<0.05),moreover the DAT group was lower than the MCI group(P<0.05).The exosomal miR-193b levels in serum of the patients with MCI and DAT were significantly lower than that of the control group(P<0.05).Conclusion The exosomal miR-193b in serum and cerebrospinal fluid may be a potential biomarker of AD,especially for its early stage.

Alzheimer′s disease; exosome; microRNA; biomarker

国家自然科学基金青年基金资助项目(81401734)；教育部博士点基金资助项目(20121107110001)。

刘辰庚，男，主管技师/讲师，博士，主要从事衰老和相关疾病标志物筛选方面的研究。△

，E-mail:pcw1905@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.002

A

1672-9455(2015)16-2301-03

2015-02-10

2015-05-10)