苦碟子注射液对兔下颌骨骨折愈合的影响①

段 峰，刘德军 (.佳木斯大学附属第二医院口腔医院，黑龙江 佳木斯 5400；.佳木斯大学研究生学院口腔医学专业，黑龙江 佳木斯 5400)



苦碟子注射液对兔下颌骨骨折愈合的影响①

目的：探讨苦碟子注射液在兔下颌骨骨折愈合恢复过程中的影响。方法：健康的新西兰大白兔30只,兔的年龄11～12w,体重2.2～2.5kg。随机分为A、B组,每组15只(雌雄不限),A组为实验组,B组为对照组。在兔的左侧下颌骨体部做2.0mm×10.0mm的骨折模型。A组建模术后第2日开始每天1次给予腹腔注射苦碟子注射液(10mL/kg),B组作为对照组不做任何处理。各组分别在术后1w、3w、5w的时间点上截取兔的左侧下颌骨行HE染色,骨形态发生蛋白(BMP-2)免疫组化学染色观察,骨密度测定,X线测定和血清钙素的测定。结果：术后3w、5w时A组的骨形态发生蛋白的表达效果均强于B组(P<0.05);术后1w、3w、5w各时间点的骨密度测定,3w、5w比较明显,在5w时各组骨密度达最大值,A组骨密度值均高于B组(P<0.05);术后1w、3w、5w经X线测定评分A组优于B组(P<0.05);血清钙素水平在1w、3w、5w时A组均较B组增高明显(P<0.05)。结论：苦碟子注射液能积极有效的促进兔下颌骨骨折的愈合。

苦碟子注射液；兔；骨折愈合；BMP-2

随着经济的发展,交通的发达,车祸外伤造成的颌面部骨折已成为口腔颌面外科常见病和多发病。目前西医主要通过骨折的内外固定,电刺激,生物原刺激等来修复骨组织的愈合再生。本实验主要研究探讨中药制剂苦碟子注射液在兔下颌骨骨折术后恢复阶段产生的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂、器材

新西兰白兔30只(体质健康，雌雄不限),兔的年龄11～12w,重量2.2～2.5kg(大学动物实验中心),苦碟子注射液(通化华夏药业集团),Ⅲ型X线机(日本岛津公司),骨密度扫描仪器(佳木斯大学附属医院),骨形态发生蛋白-2(BMP-2)抗体∕SABC免疫组化学试剂盒∕DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 兔下颌骨骨折模型的制备及实验分组

实验所用的30只新西兰大白兔术前禁食水10h,禁食水10h后10%水合氯醛给予腹腔注射麻醉,(4mL/kg)，待其麻醉后术区消毒,遵循无菌操作步骤，于左侧下颌骨体部用一次性手术刀切开下颌骨体部术区,剥离组织，显露骨质,在下颌骨体部用牙科高速涡轮钻制作2.0mm×10.0mm骨缺损断裂模型。术区0.9%氯化钠盐水冲洗,检查无异常后逐层缝合术区创口。术后随机分为A、B组饲养(A为实验组,B为对照组),每组15只。术后当日每组兔子连续5d给予庆大霉素4万单位肌注,每日一次,随时观察术区伤口有无感染化脓迹象。术后第2日开始,A组每日给予苦碟子注射液腹腔注射(10mL/kg),每日一次 共35d。B组作为对照组不做任何处理。

1.3 检测指标

1)血清钙素含量的测定：两组实验兔子分别于术后1w、3w、5w,每组随机抽取5只采取耳缘处的静脉血2mL,4℃条件下静置4h,于离心机中离心10min后取出(4000r/min),取上层血清液,测定其中骨钙素含量。

2)骨密度与X线测定：术后1w、3w、5w,每组随机抽取5只,以4%多聚甲醛心内灌注后处死,取左侧下颌骨术区及两端骨折标本长约2.5cm,骨密度扫描仪检测每组兔子骨折处的骨密度值,X线片摄取(距离8cm,,曝光3s,电压50kV,电流30mA),对每组骨折愈合情况进行对比分析。

3)组织学观察：术后1w、3w、5w切取的骨折部位标本待骨密度测定完成后,10%多聚甲醛固定20h后,13%螯合剂脱钙液脱钙20d, 80%、90%、95%、100%各种浓度乙醇梯度脱水2h，将包埋框合成模型槽，放入组织注入石蜡包埋,附加标签，将修正好的蜡块放在金属持蜡器上制成厚约6μm的切片,将切片行苏木素-伊红染色,在光镜下观察骨折处骨痂中胶原的沉淀和软骨的生成状况,采集新生的骨小梁图像,用图像分析软件进行分析,逐个算出视野中新形成的骨占原有骨面积百分比。免疫组化检测 部分切片行骨形态发生蛋白免疫组织化学染色,测量其灰度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血清钙素测定

术后1w、3w、5w分别采取两组兔耳缘静脉血，1wA,B组的血清钙素水平呈平稳缓慢增高,3wA组增长幅度较B组更明显, 术后5w血清钙素水平达最大值，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 术后1w、3w、5wA,B组血清钙素测定

组别1W3W5WA3.82±0.274.26±0.314.75±0.42B2.51±0.152.95±0.263.34±0.28

与B组比较P<0.05。

2.2X线显示结果

术后1w,A、B两组骨折处X线片上骨折痕迹明显,未见断端桥接,A组骨折处新形成骨痂面积略大于B组。术后3w,A组术区骨折痕迹变得模糊,骨折处有连续的大面积骨痂形成,骨折处已桥接,B组骨折处仍可见骨折线,骨痂体积较小,骨折断端才开始桥接。术后5w,A、B两组骨折处均已桥接,A组骨折处新形成的骨痂体积较大, 骨折处塑形较好，密度接近于皮质骨,部分髓腔出现再通,骨折痕迹基本消失不见,恢复程度达骨性愈合标准,B组在骨折处骨痂形成体积相对较小,骨折处骨痂密度较低,塑形略差，各方面均明显不及A组,见图1。术后各时间点A组X线评分高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 X线评分标准

与B组比较P<0.05

A组术后1W A组术后3W A组术后5W

B组术后1W B组术后3W B组术后5W

2.3 骨密度测定

术后1w、3w、5w2组实验动物骨折处的骨痂密度及灰度值均呈现增长趋势,其中注射药物的A组较对照组B增长明显,差异有统计学意义(P<0.05),在实验5w达最大值,见表3。

表3 术后不同时间骨密度及BMP-2免疫组织化学灰度值

与B组比较P<0.05

2.4HE染色观察

HE染色后5w,A组骨折断端处可见大量软骨细胞,骨细胞,软骨基质,且有大量编织骨与板层骨,A组可见连续且粗大的骨小梁,表面见成骨细胞,B组骨小梁发育生长较差,骨小梁细小且数量少,连续性较低。

2.5BMP-2免疫组织化学观察

术后1w、3w,A组骨痂呈肥大型较B组明显,骨化区骨形态发生蛋白呈阳性,5w时阳性较明显,B组呈弱阳性,术后1w、3w、5w,A组骨形态发生蛋白免疫组化灰度值均大于B组,术后3w、5w差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

3 讨论

临床工作中,由于肿瘤、外伤、炎症等造成的骨缺损是医生常见问题。骨缺损的延期愈合或者不愈合常常困扰患者及临床医生,如何更好、更快的使骨折尽早愈合一直是大家探讨的热门课题。本实验主要探讨中药制剂对骨折缺损修复的影响。骨折愈合是复杂的修复过程, 骨折后骨折端及周围组织将出现炎症反应、血肿机化、细胞增生及钙化等一系列过程，最后恢复骨的连续性，达到骨愈合。骨折愈合是一个很复杂的问题，受多种因素的影响。各个阶段均是有典型的生物学及组织学特征,该过程是各种因素相互协同、拮抗的结果。因此,我们探讨一种药物对骨折愈合的影响,应从多方面进行检测。实验中X线片观察示苦碟子注射液可使骨折断端处钙盐沉积量增加,增加骨痂形成体积和范围，加快骨小梁生长和重建。骨力学强度体现了骨组织密度的高低,本实验中苦碟子注射液对骨密度起到促进作用,增加骨折区骨力学强度。血清钙素与骨钙素含量成正相关,血清中骨钙素的含量对了解骨生理、代谢的变化及成骨细胞功能状态是有一定意义的。苦碟子注射液能显著促进成骨细胞活性,加速矿化进程,骨形态发生蛋白是骨缺损修复再生的重要生长因子,主要起诱导间充质细胞的分化增殖为成骨细胞,促进成骨细胞分化和胶原合成,形成新骨。因此,通过检测实验中骨形态发生蛋白含量就可以大致掌握骨痂形成状况。A组3w、5w时,骨折区骨形态发生蛋白含量明显高于B组,且差异有统计学意义。说明苦碟子注射液通过促进骨细胞形成来加速骨折愈合进度。综上所述,从动物实验结果来看,苦碟子注射液可以明显的增加骨折区骨痂面积、成骨细胞数量、骨小梁密度和塑性情况,显著提高骨折处骨密度,矿物质含量,促进骨形态发生蛋白表达,有利于骨折愈合。

[1]青少汀,宝丰,坎印.实用骨科学[M].北京:北京人民军医出版社,1999，23-27

[2]毕月玲,李晶,李平.单位中药治疗骨质疏松的研究进展[J].天津中医药,2009,26(6):524-526

[3]郭书全,许建中.BMP-2诱导成骨及传递的研究进展[J].第三军医大学学报,2005,27(16):707-710

[4]吴阶平,董家训.外科学[M].北京:人民卫生出版社,1992，208

[5]李众，周世泰，杜文延，等.跟骨骨折手术治疗的临床体会[J].黑龙江医药科学，2011，34(4)：31-32

[6]韩娜,张殿英,王天兵，等.降钙素基因相关肽对大鼠胫骨骨折早期愈合的影响[J].第三军医大学学报,2008,30(21):2011-2014

[7]戴锦娜,尹然,陈晓辉,等.苦碟子化学成分和药理作用研究进展[J].西北药学杂志,2006,(02):94-96

[8]唐华羽，李晓涛，李长德，等.跟骨骨折52例治疗体会[J].黑龙江医药科学，2012,35(3)：80-81

[9]高晟,周静.苦碟子注射液临床应用研究进展[J].现代药物与临床,2012,3(02):180-182

[10]陈新悦,张金梅.苦碟子临床应用中不良反应[J].中国药业,2008,17(24):62

[11]刘沛.苦碟子注射液的药理作用和临床应用研究进展[J].中国药师,2008,(12):1445-1447

段峰(1972～)男，黑龙江佳木斯人，副教授，硕士研究生导师，副主任医师，主要从事口腔颌面外科临床及研究工作。

刘德军(1981～)男，黑龙江哈尔滨人，在读硕士研究生。E-mail：394133047@qq.com。

段 峰1，刘德军2(1.佳木斯大学附属第二医院口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学研究生学院口腔医学专业，黑龙江 佳木斯 154002)

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1008-0104(2015)03-0120-02

2014-11-25)