神经干细胞对AD大鼠行为及突触素Ⅰ表达的影响①

杜红蕾,宋春雨,魏春杰,王泽宇,韩 凤,杨晓玉,盛宝英

(佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江 佳木斯 154003)



神经干细胞对AD大鼠行为及突触素Ⅰ表达的影响①

杜红蕾,宋春雨,魏春杰,王泽宇,韩 凤,杨晓玉,盛宝英

(佳木斯大学附属第一医院神经内科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：探究神经干细胞(NSCs)移植对β-淀粉样蛋白(Aβ1-42) 诱导的阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆能力及海马组织内突触素I表达的影响。方法：采用β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)注射到大鼠海马组织内建立阿尔茨海默病(AD)大鼠动物模型，通过Y 迷宫测试大鼠学习记忆能力和Western blot 技术检测大鼠海马组织内Synapsin I表达。结果：与对照组比较，AD模型组、细胞移植组大鼠学习记忆和大鼠海马组织内Synapsin I蛋白表达量均低(P<0.05),与AD模型组比较，细胞移植组大鼠学习记忆能力和大鼠海马组织内SynapsinI蛋白表达量均较高(P<0.05)。结论：NSCs能显著改善AD大鼠的学习记忆能力，可能与上调突触素Ⅰ的表达有关。

神经干细胞；移植；阿尔茨海默病；突触素I

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)俗称老年痴呆症，是一种以认知功能障碍为主要临床表现的神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不十分清楚，目前临床药物治疗该疾病的效果不甚理想。现有关神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)治疗老年痴呆症在动物实验取得了可观的疗效[1]。突触素I(SynapsinI)是突触素家族最早发现位于突触囊泡膜上的一种特异性磷酸化神经蛋白质，它在突触可塑性和神经信号传导过程中发挥了重要的作用，它的表达与突触的再生、延伸与其功能的恢复有关[2]。突触连接是神经元细胞间信息传递的重要结构，也是生物学习和记忆的神经生物基础；SynapsinI分布可间接的反应突触连接的数量及密度，突触素I的变化情况能准确的映射出神经元突触的改变，是突触重塑的理想标志[3]。本实验通过NSCs移植到AD模型大鼠海马组织中，观察对大鼠学习和记忆能力及海马组织中SynapsinI蛋白表达的影响，为探讨AD疾病具体发病机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

10周龄成年Wistar大鼠30只和孕期为14dWistar大鼠1只，体重(230±10)g，SPF级；所有大鼠均由佳木斯大学实验动物中心提供和饲养，实验过程符合我国相关伦理学规定。30只大鼠随机分为:细胞移植组、对照组、AD模型组， 每组各10只。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：DMEM/F12(北京康为世纪)、胰蛋白酶(北京中杉)；多克隆兔抗突触素I抗体(SantaCruz)，辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(SantaCruz)、β-actin鼠单克隆抗体(北京康为世纪)、HRP标记抗山羊IgG(武汉博士德)；Aβ1-42(美国Sigma公司)主要仪器：CO2恒温培养箱(ThermoForma公司)，Y型电迷宫(张家港生物医学仪器厂)，大鼠立体定向仪SN2型(日本东京成茂科学器械研究所)，垂直电泳槽(北京六一仪器厂)，转膜仪(德国GE公司)。

1.3AD动物模型制备、神经干细胞培养及移植 1.3.1AD动物模型制备

采用β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导方法制备AD模型[4]：在无菌操作下把Aβ1-42溶于生理盐水中，置于37℃孵育7d以上，使其形成聚集状态的Aβ备用；大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，将其固定在立体定位仪上，术区常规消毒，参照包新民等[5]的《大鼠脑立体定位图谱》，选择双侧海马区作为注射靶区，位置距前囟向后3.0mm、中线侧开2.2mm处，用微型钻头钻开颅骨，垂直于大脑表面用微量进样器进针2.8mm，然后将5μL呈聚集状态的Aβ以每分钟1μL速度缓慢注入，留针时间不少于10min。逐层缝合切口，术后每天腹腔注射抗生素，饲养7d后行Y迷宫测试，学习和记忆认知能力降低则表明制模成功。

1.3.2 神经干细胞体外培养

NSCs培养方法参照文献[6]：取孕2周的Wistar大鼠腹腔麻醉后断颈处死，在无菌操作下行剖宫取出胚胎，分离得到全脑组织后用HBSS液反复冲洗；用无菌剪刀将全脑剪成小块组织，加入0.25%胰酶消化后，用巴氏吸管反复多次吹打，使其成为单细胞悬液，转入含有bFGF和EG培养基的培养瓶中，放

置在温度为37℃恒温条件下5%CO2培养箱中培养。每天取样镜检观察细胞形态，形成原代克隆球后，在次机械分离使其形成单细胞悬液， 按上述条件继续培养进行传代培养(1:2或1:3比例)，5～7d传代一次，方法同上。

1.3.3 神经干细胞移植

取传代培养至4代的神经干细胞球配置成细胞浓度为1x104/μL细胞悬液；对照组大鼠只麻醉不做处理；细胞移植组大鼠按照制备AD模型的方法进入海马区，注入上述细胞悬液5μL注射；AD模型组则注射5μL的生理盐水做对照。术后麻醉清醒后分笼饲养28d后行Y迷宫测试行为学观察。

1.4Westernblot法检测大鼠海马组织内突触素Ⅰ的表达

大鼠饲养28d后断颈处死取海马组织，经裂解、离心、8%SDS-PAGE分离、转膜(PVDF膜)后分别加入一抗(稀释1:1000)，4℃湿盒孵育过夜，TTBS洗膜4次时间为5min，再加入二抗(稀释1:3000)，20℃孵育2h，再次TTBS洗膜4次时间为10min，最后将膜放在含SuperSignalWestPico底物工作液中孵育5min，吸干残留试剂。曝光显色拍照后利用Visionworks6.3.3图像检测各条带灰度值与GAPDH条带灰度值作比值，得出各样品相对蛋白含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为学检测

Y迷宫测试：实验前所有大鼠测试结果均为正常未见明显差异(P>0.05)；术后饲养28d大鼠行Y迷宫测试结果：与对照组比较，AD模型组和细胞移植组大鼠学习和记忆均低，且统计学有差异(P<0.05)；与AD模型组比较，细胞移植组大鼠学习和记忆能力，差异有统计学意义(P<0.05)见表1。

表1 各组大鼠Y迷宫测试结果

注:与对照组比较，aP<0.05;与AD模型组比较bP<0.05。

2.2Westernblot检测海马组织内SynapsinI表达

Western结果显示：对照组大鼠海马组织中SynapsinI蛋白条带宽而颜色深；与对照组比较，模型组和细胞移植组SynapsinI蛋白条带均明显变细颜色变浅；细胞移植组与AD模型组比较，细胞移植组SynapsinI蛋白条带较AD模型组条带宽且颜色深，即细胞移植组海马内SynapsinI蛋白的表达明显高于AD模型组，见图1。

图1 大鼠海马组织中SynapsinI的表达

备注：1泳道为对照组、2泳道为细胞移植组、3泳道为AD模型组

SynapsinI/GAPDH相对灰度值结果显示：与对照组比较，细胞移植组和AD模型组SynapsinI光密度值明显降低，则SynapsinI蛋白表达量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明AD大鼠下调了海马组织中神经细胞膜上SynapsinI的表达；与AD模型组比较，细胞移植组SynapsinI光密度值明显增加，则SynapsinI蛋白表达量较高，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明移植NSCs的上调了AD大鼠海马组织中神经细胞膜上SynapsinI的表达，见图2。

图2SynapsinI在海马组织中的表达变化(注*表示P<0.05)

3 讨论

突触是两个神经细胞传递神经递质信号的重要结构。有研究表明，在阿尔茨海默病早期，突触可出现快速的退行性改变，其退变可遍布包括海马组织在内几乎所有的新皮质[7]。突触素I(SynapsinI)是突触素家族最早发现的位于突触囊泡膜上的一种特异性磷酸化神经蛋白质，它在突触可塑性和神经信号传导过程中发挥了重要的作用，它的表达与突触的再生、延伸与其功能的恢复有关[2]。突触连接是神经元细胞间信息传递的重要结构，也是生物学习及记忆的神经生物基础；SynapsinI分布可间接的反应突触连接的数量及密度，SynapsinI的变化情况能准确的映射出神经元突触的改变，是突触重塑的理想标志[3]。本实验选用2周龄大鼠胚胎全脑组织分离培养NSCs，经原代及传代培养后, 经证实将具有自我增殖能力的第4代NSCs采用立体定位法移植到AD模型大鼠海马组织内，饲养28d后通过Y迷宫检测实验大鼠的学习和记忆能力，结果显示实

验前各组大鼠学习记忆未见明显差异(P>0.05)；饲养28d后AD模型组和细胞移植组大鼠学习记忆均低于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)；与AD模型组比较，细胞移植组大鼠学习记忆能力高于AD模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，这验证了李京凤等[8]人的研究结果。Westernblot结果显示，饲养28d后AD模型组和细胞移植组大鼠海马组织SynapsinI蛋白表达量均低于对照组，与AD模型组比较，细胞移植组大鼠海马组织SynapsinI蛋白表达量高于AD模型组，张冰清等[9]人研究发现血管性痴呆大鼠海马组织中SynapsinI较正常大鼠表达含量低、分布少，这也间接提示突触结构数量减少；这与本文研究的结果基本一致。因此，移植的NSCs可以改善AD模型大鼠的学习、记忆能力，这提示移植的NSCs可以促进海马组织中神经元的恢复；这可能是移植的NSCs影响了海马中神经元合成SynapsinI的能力，促进了轴浆运输或抑制了神经元的衰老或促进新蛋白质的合成，最终增加了SynapsinI在突触终末的含量。SynapsinI含量的上升活跃了突触结构中信息的传递，继而增强了海马学习记忆能力。

本实验采用NSCs立体定位法移植AD模型大鼠后，上调例海马组织内SynapsinI蛋白表达，这可能是由于移植的NSCs改善了海马组织局部的微环境，增加突触的形成及神经递质的释放，增强了神经元细胞信息传递功能，继而改善了AD大鼠学习和记忆能力。所以AD大鼠海马组织微环境中SynapsinI蛋白表达上调可能是NSCs改善AD大鼠学习和记忆功能的机制之一；为将来NSCs运用于临床治疗阿尔茨海默病提供实验依据。

[1]杨春，白琳琳，王书春，等.移植入阿尔茨海默病大鼠海马内神经干细胞的存活、迁移和分化[J].中国老年学杂志，2010，30(6)：779-781

[2]刘立军,黄昕艳,刘爽,等.Aβ25- 35对原代培养小鼠皮层神经元突触素和PSD-95表达的影响[J].黑龙江医药科学, 2012，35(2)：50-51

[3]辛洪启，陈乃宏.突触素在神经元发育过程中的作用[J].国外医学神经病学神经外科学分册，2003,30(3):253-256

[4]刘剑非，陈红，任常山,等.β淀粉蛋白脑室内注射建立阿尔茨海默病大鼠模型[J].中国神经精神疾病杂志，2005，31 (2): 145-147

[5]包新民, 舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京: 人民卫生出版社, 1991，44

[6]孟磊，周文科，金保哲，等.成年SD大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养和鉴定的改良[J].中国实用神经疾病杂志，2014，17(8)：1-5

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[8]李京凤,朱晓峰. 神经干细胞在Alzheimer病治疗中的应用[J]. 黑龙江医药科学, 2014，37(5)：97-100

[9]张冰清，王玉良.血管性痴呆大鼠海马synapsinⅠ及其磷酸化水平的动态变化[J].中国病理生理学杂志，2008，24(10)：1980-1984

The Effects of neural stem cells on ethology and expression of synapsin I in aged rats

DUHong-lei,SONGChun-yu,WEIChun-jie,WANGZe-yu,HANFeng,YANGXiao-yu,SHENGBao-ying

(Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Objective：To explore the neural stem cells (NSCs) transplantation on Aβ1-42induced effects of learning and memory ability and hippocampus synaptophysin I expression in alzheimer's disease rat.Methods：A β1-42 injection method was used to establish rat hippocampus in Alzheimer's disease (AD) rat animal model. Rat’ learning memory ability was tested by Y maze mehod. The I expression in hippocampus tissue of rats was detected by the technology of blot Western.Results：In AD model group, cell transplantation study group, rats’ memory ability and the protein expression of Synapsin I in hippocampus were low compared with the control group (P<0.05).Incelltransplantationstudygroup,rats’memoryabilityandtheproteinexpressionofSynapsinIinhippocampuswerehighcomparedwiththeADmodelgroup(P<0.05). Conclusion: NSCs could significantly improve the learning and memory ability of AD rats, which may be related to the upregulation of the expression of synapsin I.

neural stem cells; transplantation; alzheimer’s disease; synapsin I

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12531698；黑龙江省高校科技创新团队项目，编号：2012TD013；佳木斯大学研究生创新基金，编号：LZR2014_018。

杜红蕾(1988～)女，黑龙江铁力人，在读硕士研究生。

盛宝英(1964～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail: shengbaoying123@163.com。

R338.1；R742.8+

A

1008-0104(2015)03-0001-03

2015-02-03)