泛素蛋白酶体系统在Wnt通路中的研究进展

【摘要】Wnt信号传导通路是一个由多种分子参与、相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系，与细胞信号转导、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞黏附和迁移以及干细胞的分化潜能等有关。泛素蛋白酶体系统通过调控蛋白活性、亚细胞定位以及蛋白间相互作用等方式在细胞活动中发挥重要的作用。Wnt信号传导通路中β-catenin等关键分子受泛素蛋白酶体途径精密调控。本文就泛素蛋白酶体系统和Wnt通路信号传导相互之间的关系作一综述。

泛素蛋白酶体途径由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、26S蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素蛋白酶体途径在各种细胞活动中均发挥着重要的调控功能，如胞膜蛋白运输、细胞周期调控、病毒感染、DNA修复和基因转录等。Wnt信号通路也称为Wnt/β-catenin信号通路。Wnt信号通路未激活时，胞浆内的β-catenin一部分与细胞膜上的钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)结合，一部分与轴蛋白(Axin)、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、酪蛋白激酶1(casein kinase，CK1)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)形成复合物，继而被磷酸化，磷酸化的β-catenin被泛素连接酶E3识别并泛素化，最终导致β-catenin通过蛋白酶体途径被降解。当Wnt蛋白与其受体蛋白结合后，受体蛋白通过与Dsh的相互作用及一系列胞质蛋白的相互作用使β-catenin在细胞浆内积累继而转位入核，与核内转录因子TCF/LEF1共同作用，激活下游靶基因，最终导致Wnt信号通路激活。

1　经典的Wnt信号通路与恶性肿瘤

APC基因的突变可以导致家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)［1］。资料证明，约有85％的散发性结肠腺癌患者的发病与APC基因的突变有关［2］。突变的APC基因缺失了与Axin的结合序列，因而不能与Axin、CK1和GSK-3β形成β-catenin磷酸化复合体，导致细胞质内游离的β-catenin积累，Wnt途径异常激活［3］。动物实验表明，截短突变APC基因的小鼠结肠腺癌发病率显著升高，而保留了Axin结合位点的突变APC基因没有产生肿瘤［4］。

目前对于结直肠癌中基因突变情况的统计结果差异较大。一些学者［5-6］认为结直肠癌中β-catenin基因突变极少，只有10％左右。也有研究者认为较为普遍，约占40～50％。但绝大多数认为，在约15％APC基因未突变的结肠腺癌患者中，β-catenin基因存在点突变［7］。β-catenin基因突变后通过下面两种方式激活Wnt途径:①β-catenin不能被βcatenin降解复合体有效降解。当β-catenin的氨基末端与GSK-3β和CK1结合的的Ser/Thr残基位点突变后，β-catenin磷酸化受到抑制。②β-catenin与E-cad的结合力减弱而不能被束缚在胞膜上，导致细胞质内游离的β-catenin增多。例如低剂量的次级胆酸即可诱导β-catenin的tyr残基磷酸化，抑制β-catenin与E-cad结合［8］。

β-catenin/Tcf转录复合体激活c-myc和cyclinD1的表达，对肿瘤的发生发展起着重要作用［9］。研究表明在结直肠癌中，原癌基因c-myc在mRNA水平和蛋白质水平上都存在过度表达［10］。c-myc通过抑制细胞周期依赖小片蛋白激酶(cyclin-dependent kinase CDK)的抑制因子p21，促进G1/S期的进行［11］，cyclin D1则能直接激活G1期的CDK［12］。

2　泛素-蛋白酶体系与恶性肿瘤

抑癌基因p53编码的P53蛋白在正常细胞中是不稳定的核蛋白。它能发现DNA损伤并进行修复，如果未能完成修复，则诱导细胞凋亡，防止细胞癌变［13］。在肿瘤细胞中，p53失活一方面是由基因突变造成的，另一方面与泛素蛋白酶体对其异常的降解有关［14］。介导P53泛素化降解的是泛素结合酶UbcH8和泛素化连接酶E6-AP。E6-AP能与人乳头瘤病毒E6癌蛋白结合形成E6-E6-AP复合物，该复合物与P53特异性结合，诱导P53降解［15］。

P27蛋白是一种细胞周期依赖性激酶抑制剂，是细胞周期中G1/S期的负调控因子之一，主要抑制cyclinD-CDK、cyclinE-CDK等激酶复合物，阻止细胞从G1期进入S期。研究发现，体内外的P27蛋白均通过泛素-蛋白酶体降解。靶向降解泛素化P27蛋白的是E3连接酶SCF(Skp1-Cullin-F-box)复合物。SCF复合物是由Skp2、Skp1、Cullin-1等亚基构成，其中Skp2是底物识别亚基。Skp2作用于磷酸化的P27，使其通过泛素蛋白酶体途径降解［16］。癌基因c-myc可以激活泛素连接酶SCF中的Cullin基因表达，诱导SCF复合物降解P27。Masuda等［17］研究表明: Skp2与P27呈负相关，Skp2的高度表达与胃癌的不良预后相关。Yokoi等［18］研究提示，沉默Skp2基因显著抑制肺癌细胞的生长。

β-TrCP是真核细胞中的一种F-BOX蛋白。由于β-TrCP底物功能的多样性，β-TrCP既表现出致癌的功能，又具有抑癌的功能。在许多肿瘤细胞中都发现了β-TrCP的过表达，对结肠腺癌组织的研究发现，β-TrCP在基因水平和蛋白质水平上均与细胞的抗凋亡能力呈现正相关［19］。VHL(Von Hippel-Lindau，VHL)基因产物pVHL是E3连接酶的组成成分之一，介导缺氧诱导因子(hypoxia inducible faclor，HIF)泛素化降解，可抑制肿瘤间质血管的生成。有实验证明，VHL基因沉默的肾细胞癌的裸鼠模型中，导入VHL基因后，肿瘤生长受到抑制［20］。Zimmer等［21］发现转染了VHL cDNA腺病毒载体的肾癌细胞株，凋亡增加，暗示VHL与肿瘤细胞的凋亡有关。

Bromberg等［22］发现泛素连接酶RNF5在乳腺癌标本和细胞系中高标达，抑制RNF5的表达可以使肿瘤细胞生长受阻，RNF5高表达的患者生存期缩短。Chen等［23］检测前列腺癌标本发现WWP1(一种泛素连接酶)基因表达水平显著增强。在PC-3细胞株中，抑制WWP1基因后，细胞生长受阻。泛素连接酶HDM2在正常组织中表达很低，而在乳腺癌、软组织肉瘤、食管癌、肺癌等肿瘤中呈高表达。HDM2靶向诱导p53泛素化降解。研究发现，通过抑制HDM2的活性可以恢复p53的功能，促进肿瘤细胞的凋亡［24］。Tsai等［25］研究发现靶向沉默泛素连接酶pg78后，肉瘤细胞系的迁移能力减弱。

3　经典Wnt通路信号分子与泛素连接酶E3

继β-catenin发现后不久，研究者发现β-catenin的转录后调控在Wnt信号通路的信号传导过程中发挥着及其重要的作用。靶向降解磷酸化的βcatenin的E3连接酶β-trcP的发现，对于依赖磷酸化的泛素蛋白酶体途径有了更深刻的认识。β-trcP 是RING家族(泛素连接酶E3)成员SCF复合物的底物识别亚基。β-trcP被磷酸化β-catenin的识别序列(DSG(X)2 + nS)识别后，SCF复合物便将泛素化多肽链转移至β-catenin氨基末端的赖氨酸残基上(Lys-19和Lys-49)，诱导其进入蛋白酶体降解途径［26］。

3.1.1Siah-1Siah-1基因是RING家族的一员，活化的p53基因诱导Siah-1基因的表达。Siah-1蛋白一端与APC蛋白的羧基端结合，一端与β-catenin的臂重复序列结合，促使β-catenin的泛素化。Siah-1对β-catenin的泛素化修饰与β-TrCP完全不同。Siah-1既可以单独与E2交联酶UbcH5a53结合介导底物蛋白的泛素化，也可以与Siah-1结合蛋白(SIP)、Skp1、APC、TBL1/Ebi组成SCFTBL1复合物后再与UbcH5a53复合物结合介导泛素化。研究发现，Siah-1分子比SCFTBL1复合物对β-catenin具有更强的亲和力，但是关于两种复合物的功能和识别底物的特异性尚不清楚［27］。Siah-1与β-trcP不同，它可以识别非磷酸化的β-catenin。所以磷酸化位点发生突变的β-catenin也不能摆脱Siah-1介导的泛素蛋白酶体的调控。

3.1.2Jade-1近期研究发现，在肾细胞内E3连接酶新成员Jade-1以VHL依赖的蛋白降解机制下调细胞内β-catenin。VHL是肾癌中容易突变的一个肿瘤抑制因子，它是E3连接酶的一个亚基。在正常的肾组织中，Jade-1与VHL均高表达。与βtrcP相同，Jade-1直接与磷酸化β-catenin的N-端位点结合，但是Jade-1参与β-catenin的泛素化修饰与β-trcP的方式却不尽相同。非洲爪蟾体内和体外实验表明，无论Wnt通路激活还是关闭，Jade-1均可以以泛素化修饰β-catenin，调控其在胞内的水平［28］。蛋白定位分析显示细胞核内分布有大量的Jade-1，暗示它主要调控细胞核内的β-catenin。由于Jade-1蛋白的稳定性取决于有功能的VHL蛋白，所以在肾癌细胞中Wnt通路激活可能是由于VHL突变导致Jade-1下调［29］。Jade-1是否与Wnt通路的其他成分相关，Jade-1蛋白是否还受其他蛋白调控，在其他恶性肿瘤中是否存在VHL调控Jade-1，这些问题还有待于进一步的研究。

3.1.3β-catenin/E-cad与Hakai、Ozz-E3选择性的泛素化降解细胞膜上与E-cad结合的β-catenin分子可以导致细胞之间粘连性减弱。E3连接酶Hakai(RING家族)可以泛素化修饰E-cadherin和β-catenin。泛素化的E-cad/β-catenin复合物通过细胞内吞作用进入胞质，细胞与细胞之间的连接损坏，细胞迁移能力增强。细胞内高表达的Hakai可能在上皮细胞向间皮细胞发展的过程中发挥重要作用［30］。在横纹肌的生长过程中，E3连接酶亚基Ozz依赖细胞因子信号抑制物(suppressor of cytokine signaling，SOCS)保守区域与Elongin B/C、Cullin-5 和Rbx1等蛋白形成复合物对底物蛋白进行泛素化修饰。在肌细胞膜上，Ozz选择性的结合β-catenin，促使其泛素化降解。所以说在肌细胞膜的形成过程中，Ozz起着至关重要的作用［31］。

研究发现，将Wnt3a基因加入到细胞内，细胞内的Axin蛋白水平降低，APC蛋白水平升高，这些暗示APC和Axin蛋白直接受Wnt通路的调控［32］。当Wnt通路激活时，诱导Axin去磷酸化。去磷酸化的Axin易被泛素蛋白酶体降解。由于Axin蛋白的缺失，APC-Axin复合物在体内大大减少。有研究者提出APC蛋白可能在Axin的降解途径中发挥作用，但是Axin降解的作用机制还需要进一步的研究［33］。

已报道APC是泛素蛋白酶体系统识别的底物，因Axin蛋白过表达而降解。APC和Axin这种相互间的调控可以更有效的调控细胞内β-catenin，但是至今还未确定降解APC蛋白是哪一种E3连接酶。在细胞内，去泛素化酶(USP15)维持APC泛素化降解的动态平衡［34］。USP15是COP9信号小体(Constitutive Photomorphogenic siganlsome，CSN)复合物的亚基，CNS具有调控SCF复合物的功能。在Wnt通路中，CNS和SCFβ-TRcP复合物紧密相关。CNS复合物活化SCFβ-trcP复合物，而USP15亚基具有稳定APC蛋白的功能，最终导致细胞内的APC-Axin复合物增多，β-catenin下调。当Wnt通路激活时，CSN复合物将从SCFβ-TRcP复合物和APC-Axin复合物中解离，导致APC泛素化降解。APC蛋白的急剧减少，促进了β-catenin在细胞内的稳定性。

4　结论

泛素化蛋白酶体通过对Wnt通路中关键分子的稳定性、受体蛋白成熟、膜蛋白运输和蛋白质功能的调控在Wnt信号通路活化过程中发挥作用。Wnt信号通路中的关键分子，如β-catenin和Dvl的稳定性受泛素连接酶E3复合物精密调控，而这些泛素连接酶复合物在不同的组织和不同的细胞中受不同的信号分子调控。人类很多疾病与泛素化修饰的底物蛋白的异常表达和基因突变有关，这些分子有可能会是治疗相关疾病的分子靶标。

Wnt信号通路中的某些分子不仅是泛素化修饰的底物，而且还可以调控E3连接酶对其他底物的泛素化修饰，如APC、Axin、Dvl。这些蛋白之间的调控与被调控以及他们之间的相互作用还有待进一步的研究。Wnt信号通路中泛素化酶和去泛素化酶对底物蛋白的时空调控是如何开展?介导泛素化多肽链和下游靶基因的泛素结合蛋白是否与时空调控相关?所有这些疑问还有待我们进一步的研究。

泛素蛋白酶体系通过对一些癌基因和抑癌基因的调控，在肿瘤的发生发展和肿瘤的治疗方面均发挥着重大的作用。介导癌基因和抑癌基因的泛素蛋白酶体系在时空上是否具有一致性，机制本质是否有区别，也需要我们进一步的研究发现。

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The research on the ubiquitin proteasome system in Wnt signal pathway

(Department of Anatomy，Basic Medical Institute，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China )

【Abstract】Wnt signal pathway is a complex system involved by a variety of molecular which are influenced，restricted and synergied by each other.It is related with the cell signal transduction，cell cycle，cell proliferation，migration and differentiation，apoptosis，adhesion and the potential differentiation ability of stem cells.Ubiquitin proteasome system plays an important role in cell activity through regulated the protein activity，subcellular localization，protein interaction，et al.The key moleculars in Wnt signal pathway，such as β-catenin，is closely regulated by ubiquitin proteasome system.The purpose of this paper is to elaborate the relationship of the Wnt signal pathway with the ubiquitin proteasome system.

作者简介:朱剑军(1987-)，男，山西临汾人，硕士，讲师，主要从事结直肠腺癌发病相关基因的研究。

基金项目:四川省教育厅基金项目(13ZB0242);四川省科技厅项目(2012ZZ008)

网络出版时间: 2015-5-1 01∶33网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150501.1333.030.html

泛素蛋白酶体系统在Wnt通路中的研究进展

1 经典的Wnt信号通路与恶性肿瘤

2 泛素-蛋白酶体系与恶性肿瘤

3 经典Wnt通路信号分子与泛素连接酶E3

4 结论

1　经典的Wnt信号通路与恶性肿瘤

2　泛素-蛋白酶体系与恶性肿瘤

3　经典Wnt通路信号分子与泛素连接酶E3

4　结论