转化生长因子-β1与冠状动脉支架内再狭窄关系的探讨*

黄 骥，王凤鸣,黄 婕,唐素琼,刘 筑,伊远学,王旭开,裴 芳△(中国人民武装警察部队重庆市总队医院:.心血管内科;.科教中心，重庆 40006；.第三军医大学第三附属医院野战外科研究所心血管内科,重庆 40004)



·论 著·

转化生长因子-β1与冠状动脉支架内再狭窄关系的探讨*

黄 骥1，王凤鸣1,黄 婕1,唐素琼1,刘 筑2,伊远学2,王旭开3,裴 芳1△(中国人民武装警察部队重庆市总队医院:1.心血管内科;2.科教中心，重庆 400061；3.第三军医大学第三附属医院野战外科研究所心血管内科,重庆 400042)

目的 探讨转化生长因子(TGF)-β1血浆水平及TGF-β1基因-509C/T单核苷酸多态性(SNP)与重庆地区汉族人群经皮冠状动脉介入治疗术后支架内再狭窄(ISR)发生的关系。方法 回顾性纳入冠状动脉支架术后行冠状动脉造影随访的患者368例，根据复查造影的结果将其分为ISR组152例和无再狭窄(NISR)组216例。酶联免疫吸附试验检测血浆TGF-β1水平，采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性及基因测序的方法检测TGF-β1基因-509C/T多态的基因型。结果 TGF-β1基因-509C/T多态的3种基因型和等位基因分布频率ISR组和NISR组差异均有统计学意义(P<0.05)，TT基因型和T等位基因在ISR组所占比例显著增加，与NISR组差异有统计学意义(P<0.05)；血浆TGF-β1水平ISR组高于NISR组，差异有统计学意义(P<0.05)，ISR组TGF-β1基因-509C/T多态TT和CT基因型携带者血浆TGF-β1水平均显著高于NISR组，差异有统计学意义(P<0.05)，各组内TT基因型血浆TGF-β1水平均高于CC和CT基因型，CT基因型又高于CC基因型，组内比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析显示，TT基因型、T等位基因(CT+TT基因型)和血浆TGF-β1是ISR发生的独立危险因素(OR值分别为1.82、1.61和2.01，P<0.05)。结论 高血浆TGF-β1水平、TT基因型及T等位基因携带者显著增加ISR的风险。

冠状动脉疾病； 转化生长因子-β1； 单核苷酸多态性； 支架； 冠状动脉再狭窄

冠心病作为危害人类健康的“头号杀手”受到广泛关注。尽管现代介入治疗技术的快速发展为解决冠状动脉狭窄、心肌供血等问题提供了有效的治疗手段，但术后半年内有10%～30%的患者会发生支架内再狭窄(ISR)，极大制约其临床应用[1]。因此，ISR的防治已经成为当今全球医学界研究的一项重要课题。近年研究发现，转化生长因子-β1(TGF-β1)与ISR的发生和发展关系密切[2]。位于TGF-β1基因子区的-509C/T多态(rs1800469)被证明可以通过影响TGF-β1转录水平进而影响TGF-β1的表达产物水平，从而参与多种疾病的发生和发展，但迄今少有其与ISR关系的文献报道[3]。本研究旨在探讨TGF-β1基因-509C/T多态性与ISR的关系，并探讨该多态性对血清TGF-β1水平的影响，为识别高危ISR患者，指导个体化治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性纳入2009年6月至2014年6月成功接受冠状动脉内支架置入术的重庆地区无血缘关系的汉族患者368例，其中男276例，女92例，所有患者均经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后超过0.5年，因常规检查或再发心绞痛住院复查选择性冠状动脉造影(CAG)并检测血浆TGF-β1水平；根据CAG结果，分为再狭窄组(ISR组)152例和无再狭窄组(NISR组)216例，两组患者年龄、性别均匹配。患者术后CAG随访时间中位数为9个月。患有急性ST段抬高型心肌梗死及其他心脏病，如心肌病、风湿性心脏病、先天性心脏病、瓣膜病；严重心、肝、肾衰竭；近期有大创伤或者大手术、大出血；凝血功能障碍；风湿免疫性疾病；肿瘤；近期感染及慢性炎症；对阿司匹林、肝素及氯吡格雷禁忌者均不作为研究对象。

1.2 CAG及PCI 按Judkins法行CAG，标准方法行冠状动脉内支架置入术。患者术前常规服用阿司匹林(德国拜耳制药有限公司)100～300 mg/d，顿服氯吡格雷(法国赛诺菲制药有限公司)300 mg。冠状动脉病变严重程度、长度和参照血管直径的参数测定由专人(非术者)进行定量CAG分析。支架置入成功标准：残余狭窄小于20%，血流分级为心肌梗死溶栓3级，无重要边支闭塞、无夹层、无血栓，且住院期间不伴主要心脏不良事件。术后患者接受氯吡格雷片口服，1次/天，至少12个月；阿司匹林片100 mg口服，1次/天，终身服用；同时服用需要的其他药物，如降压、降脂及硝酸酯类药物。ISR判定标准：随访时支架内或支架前后5 mm血管腔内径狭窄程度大于或等于50%，参照血管为支架远端正常血管[4]。

1.3 基因型检测 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管抽取受试者清晨空腹肘正中静脉血2 mL，使用Tuangen公司全血基因组DNA提取试剂盒提取白细胞基因组DNA。采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性(PCR-RFLP)检测TGF-β1基因-509C/T多态基因型。根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)Primer-Blast工具在线设计特异性引物：正义链5′-CCCGGCTCCATTTCCAGGTG-3′，反义链5′-GGTCACCAGAGA AAGAGGAC-3′。PCR反应总体积25 μL，包括1×PCR缓冲液，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，引物10 pmoL，Ex Taq酶0.5 U，DNA模板25 ng，去离子水加至25 μL，所有试剂均为大连宝生物公司产品。PCR扩增反应在热循环仪(Bio-Rad)上完成，扩增参数：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用限制性内切酶Eco81Ⅰ于37 ℃消化12 h，通过3%琼脂糖凝胶电泳分带确定基因型。为了确保基因分型的准确性，本研究抽取约10%的样本进行测序验证。此外，对于用PCR-RFLP无法区分基因型的样本，也采取DNA测序的方法确定基因型。DNA测序在上海生工北京测序部完成。

1.4 血浆TGF-β1测定 复查CAG前从肘静脉取血10 mL置于EDTA抗凝管中，1 500 r/min离心15 min，取血浆分装于2 mL的Eppendorf管中，置于-70 ℃保存待测；标本收齐后用酶联免疫吸附试验测定血浆TGF-β1水平，试剂盒由美国Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology Co.Ltd生产；试剂盒检测线性范围为0.25～40.00 μg/L，敏感度为0.03 μg/L，严格按照试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 ISR组与NISR组患者一般情况比较 两组患者年龄、性别、体质量指数(BMI)、空腹血糖、血脂、冠心病家族史、既往高血压、糖尿病、吸烟史、临床表型、左心室射血分数、术后药物治疗比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；同时两组靶血管部位、病变血管支数和靶病变的类型、靶病变长度、支架类型、支架长度、置入支架前后靶血管狭窄程度、参照血管直径及最小管腔直径、早期获得、最大球囊释放压力、球囊与血管直径比值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 TGF-β1基因-509C/T多态各基因型临床资料比较 TGF-β1基因-509C/T多态各基因型携带者年龄、性别、BMI、空腹血糖、血脂、冠心病家族史、既往高血压、糖尿病、吸烟史、临床表型、左心室射血分数、术后药物治疗、靶血管部位、病变血管支数和靶病变类型、靶病变长度、支架类型、支架长度、置入支架前后靶血管狭窄程度、参照血管直径及最小管腔直径、早期获得、最大球囊释放压力、球囊与血管直径比值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各基因型复查CAG相关指标比较 见表1。TGF-β1基因-509C/T多态各基因型携带者PCI术后复查CAG发现，各基因型参照血管直径比较差异无统计学意义(P>0.05)；管腔直径狭窄率比较，-509TT基因型携带者狭窄程度明显增加，其次为-509CT基因型携带者，最后为-509CC基因型携带者，但差异无统计学意义(P>0.05)；-509TT基因型携带者再狭窄发生率、迟发管腔径丢失、晚期管腔丢失指数最高，其次为-509CT基因型，最后为-509CC基因型，上述指标各基因型比较差异有统计学意义(P<0.05)；-509TT基因型携带者最小管腔直径低于-509CT基因型携带者，-509CT基因型携带者最小管腔直径又低于-509CC基因型携带者，三者之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 TGF-β1基因-509C/T多态性分析 见表2。ISR组和NISR组TGF-β1基因-509C/T多态位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡规律，提示两组人群均有较好的代表性。TGF-β1基因-509C/T多态位点的3种基因型(CC、CT、TT)和等位基因(C、T)分布频率ISR组和NISR组差异有统计学意义(P<0.05)，TT基因型和T等位基因ISR组所占比例显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，CC基因型及C等位基因ISR组所占比例显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 TGF-β1基因-509C/T多态性与ISR相关性 以CC基因型为参照，通过Logistic回归分析矫正年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、吸烟、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、非ST段抬高型心肌梗死、不稳定性心绞痛、多支病变、左心室射血分数、靶病变部位、靶病变类型、靶病变长度、术前参照血管直径及靶血管狭窄程度、支架类型、支架数量及长度、置入支架后即刻管腔直径、释放压、术后服药情况等混杂因素，结果显示，CC基因型(OR=1.82，95%CI=1.34～4.51，P=0.031)及T等位基因(CT+TT基因型)携带者(OR= 1.61，95%CI=1.07～3.79，P=0.043)是PCI术后ISR的危险因素(表3)。

表1 各基因型复查CAG相关指标比较

表2 ISR组和NISR组TGF-β1基因-509C/T多态基因型分布和等位基因频率[n(%)]

表3 TGF-β1基因-509C/T多态不同基因型与再狭窄发病风险的关联[n(%)]

注：-表示无数据。

表4 ISR组和NISR组TGF-β1基因-509C/T多态不同基因型血浆TGF-β1水平比较

注：与同组CC基因型比较，△P<0.05；与同组CT基因型比较，*P<0.05；与NISR组比较，★P<0.05。

2.6 血浆TGF-β1水平与ISR发生的关系 见表4。ISR组血浆TGF-β1水平明显高于NISR组，差异有统计学意义(P<0.05)。以是否发生支架术后再狭窄为因变量，以患者一般情况、靶血管病变情况、支架情况、术后服药情况、血化验指标、TGF-β1血浆水平、TGF-β1基因型为自变量，行二分变量Logistic回归分析，结果显示，TGF-β1血浆水平是ISR发生的危险因素(OR=2.01，95%CI=1.25～5.34，P=0.016)。

2.7 TGF-β1基因-509C/T基因型对血浆TGF-β1水平的影响 见表4。ISR组和NISR组TT基因型和CT基因型携带者血浆TGF-β1水平差异有统计学意义(P<0.05)，和CC基因型携带者差异无统计学意义(P>0.05)；不论是ISR组还是NISR组，TT基因型携带者血浆TGF-β1水平均高于CT和CC基因型携带者，差异均有统计学意义(P<0.05)，CT基因型携带者血浆TGF-β1水平均高于CC基因型携带者，差异均有统计学意义(P<0.05)，各基因型携带者血浆TGF-β1水平组内比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

冠状动脉支架的出现标志着冠心病的治疗进入了一个新的里程碑，但是ISR逐渐成为制约支架技术发展的瓶颈。目前的研究表明，血管内皮功能失调和血管平滑肌细胞(VSMCs)在多种细胞因子的刺激下发生表型改变、迁移、增殖并产生大量的细胞外基质是ISR发生机制的重要环节[5]。动物试验表明，TGF-β1可以通过多种途径影响内皮细胞黏附、凋亡及内皮素表达，进而影响损伤后的血管内皮功能[6-7]；同时，TGF-β1可以通过调节成纤维细胞和损伤血管的VSMCs增生，增加细胞间质的合成和分泌，增加细胞外基质和细胞骨架的结合，促进血管重塑[8-9]；抑制TGF-β1的表达可以减少或阻止新生血管内膜的形成和ISR发生[10-11]。在人类样本中Khan等[12]指出，在冠状动脉和外周动脉的VSMCs中，TGF-β1水平升高，与原发损伤相比，在PCI术后的再狭窄损伤时TGF-β1水平较高；Chung等在支架术后检查了人类的再狭窄损伤，发现经皮腔内斑块旋切术的20条血管中有16条重新回到原来的状态，行TGF-β1染色时呈阳性表现；同样，Yutani等检查了经皮腔内斑块旋切术冠状动脉内支架再狭窄后指出，80%的动脉内膜TGF-β1呈阳性表现；Wildgruber等对经皮冠状动脉腔间血管成形术的患者研究发现，再狭窄患者术后15 min、24 h、2周血浆TGF-β1水平均显著高于未发生再狭窄的患者。因此，TGF-β1可能在再狭窄过程中发挥很重要的作用。

本研究对368例PCI术后患者的研究发现，ISR组血浆TGF-β1水平显著高于NISR组，Logistic回归结果显示，高血浆TGF-β1水平是ISR发生的危险因素。这可能与PCI术后高水平的TGF-β1促进血管内皮细胞功能紊乱，促进VSMCs迁移、增殖，增加细胞外基质的合成，使新生内膜过度增生和血管重塑，促使再狭窄形成有关。

TGF-β1基因多态性与冠心病关系的报道较多，但迄今少有TGF-β1基因多态性与ISR关系的研究报道。目前研究发现，TGF-β1基因至少存在9个单核苷酸多态性位点，其中位于TGF-β1基因转录起始位点上游负性调控区的-509C/T多态(rs1800469)被证明可以引起TGF-β1基因的转录和表达改变，从而参与多种疾病的发生和发展。本研究结果显示，TGF-β1基因-509C/T多态基因型及等位基因频率在ISR组和NISR组分布差异有统计学意义(P<0.05)，TT基因型和T等位基因携带者再狭窄程度显著高于CC基因型携带者，TT基因型和T等位基因携带者是PCI术后ISR的独立危险因素。不论是ISR组还是NISR组，TT基因型携带者血浆TGF-β1水平均显著高于CC和CT基因型携带者，CT基因型携带者血浆TGF-β1水平又显著高于CC基因型携带者；ISR组与NISR组TT基因型和CT基因型携带者血浆TGF-β1水平存在差异，由此提示T等位基因与较高的血浆TGF-β1水平有关。这可能与-509C/T多态性位于TGF-β1基因启动子区转录起始位点上游负性调控区，-509位点C→T的基因变异可能通过改变启动子与转录因子的亲合力，增强启动子的活性，影响TGF-β1基因转录及翻译效率，进而上调TGF-β1的蛋白表达有关。

本研究人群中再狭窄患者比例占41.3%，明显高于以往报道的再狭窄率(15%～30%)，这与本研究的患者来源有关。入选患者多为接受冠状动脉介入治疗后再次出现症状后来诊，随后接受冠状动脉造影复查，与无论有无症状均于介入治疗后6个月到1年接受造影复查者相比，再狭窄的可能性更高。通过既往对于E-selectin SER129ARC多态性与再狭窄相关性研究分析，这种差异并不会影响研究结果[13]。另外，由于本研究同时纳入了置入金属裸支架和药物支架的患者，可能会对结果造成一定的困扰，毕竟金属裸支架和药物支架ISR的发病机制是不一样的。此外，本研究病例数较少，一定程度上降低了研究的把握度，易使研究结果产生偏倚，但是为未来的研究探索指明了方向。

总之，本研究发现，在中国重庆地区汉族人群中高血浆TGF-β1水平对预测PCI术后ISR有重要意义，ISR基因-509C/T多态性TT纯合子和T等位基因携带者在冠状动脉支架置入术后再狭窄危险性较高。

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Study on association between TGF-β1 and restenosis of coronary stenting*

HUANGJi1，WANGFeng-ming1，HUANGJie1，TANGSu-qiong1，LIUZhu2，YIYuan-xue2，WANGXu-kai3，PEIFang1△

(1.DepartmentofCardiology,ChongqingCorpsHospitalofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Chongqing400061,China;2.CenterofScientificResearchandTeaching,ChongqingCorpsHospitalofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Chongqing400061,China;3.DepartmentofCardiology,ChongqingInstituteofCardiovascularDiseases,ResearchInstituteofFieldSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To explore the association between TGF-β1 gene C-509T single nucleotide polymorphism(SNP) and plasma levels of TGF-β1 with the occurrence of coronary stent restenosis after percutaneous coronary intervention(PCI) in Han nationality crowd.Methods 368 patients with successful coronary stent placement and follow-up angiography were retrospectively included and divided into the in-stent restenosis (ISR) group (n=152) and non in-stent restenosis (NISR) group (n=216).Genotyping for the C-509T polymorphism was performed by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis.Plasma TGF-β1 levels were detected with the enzyme linked immuno sorbent assay(ELISA).Results The prevalence of the TT genotype,frequency of the T allele and the concentration of TGF-β1 in the ISR group were significantly higher than those in the NISR group.The C-509T polymorphism was also significantly correlated with TGF-β1 levels with the TT genotype corresponding with the highest and the CC genotype with the lowest TGF-β1 levels in both ISR and NISR group.The TT genotype,T allele carriers and plasma TGF-β1 levels were significantly associated with the risk of ISR (adjustedOR=1.82,1.61,2.01,P<0.05).Conclusion Higher plasma levels of TGF-β1,TT homozygotes and T allele carriers of TGF-β1 C-509T polymorphism have higher risk of ISR after coronary stenting.

coronary artery diseases; transforming growth factor-β1; single nucleotide polymorphisms; stents; coronary restenosis

国家自然科学基金资助项目(81200193,81370367)。

黄骥，男，博士，副主任医师，主要从事冠心病和高血压的防治。

△通讯作者,E-mail：gypeifang@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.001

A

1672-9455(2015)09-1179-04

2014-11-03

2015-02-10)