低温体外保存对血小板活化和凋亡的影响

刘立坤，高会霞，李永乾

（1.河北医科大学第三医院输血科，河北 石家庄050051；2.河北省石家庄市第五医院检验科，河北 石家庄050021）

目前，标准的血小板保存条件只有常温（22±2）℃振荡保存和二甲亚砜冷冻保存，储存不足限制了血小板临床应用。有体外实验证明，室温中保存的血小板容易失去止血功能［1］。血小板在保存期内的活化和凋亡可能是导致血小板功能降低，影响血小板输注效果的重要因素。因此，保护血小板活性、提高其体外的存活率是血小板保存面临的重要问题。本研究将血小板在不同的温度下悬浮于添加液与血浆的混合液中，观察其保存期内的活化和凋亡情况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器 血小板添加液成分：海藻糖75.00g／L、Na2HPO43.05g／L、KCl 0.37g／L、NaH2PO4·2H2O 1.05g／L、NaCl 4.05g／L、MgCl2·6H2O 0.30g／L、Na3枸橼酸·2H2O 3.18 g／L［2］；血细胞计数仪（日本Sysmex公司）；流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

1.2 血小板的制备及保存 取20份单采血小板，每份均一分为三，一份贮存于（22±2）℃振荡器（对照组），其余二份离心（1 000g，10min），保留35%血浆，加入65%的血小板添加液混匀，分别保存于10℃静置冷藏（实验Ⅰ组）及（22±2）℃振荡仪（实验Ⅱ组）。

1.3 血小板质量评价指标的检测 血细胞计数仪测定血小板计数（platelet count，PLT）；流式细胞仪检测血小板CD62p和△Ψm［3］。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件处理数据。计量数据以±s表示，采用重复测量设计资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

随着时间延长，3组PLT比较平稳，在组间、时点间以及组间·时点间交互作用差异均无统计学意义（P＞0.05）；随着时间延长CD62p逐渐升高，而△Ψm%逐渐下降，3组CD62p、△Ψm在组间、时点间以及组间·时点间差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1～3。

表1 3组PLT不同保存时间检测结果比较Table 1 PLT＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

表1 3组PLT不同保存时间检测结果比较Table 1 PLT＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

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表2 3组CD62P不同保存时间检测结果比较Table 2 CD62P＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

表2 3组CD62P不同保存时间检测结果比较Table 2 CD62P＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

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表3 3组△Ψm不同保存时间检测结果比较Table 3 △Ψm＇s results of three groups in different preservation time（n=20±s）

表3 3组△Ψm不同保存时间检测结果比较Table 3 △Ψm＇s results of three groups in different preservation time（n=20±s）

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3 讨 论

血小板是人体凝血机制中重要的血液成分，其体积小，无细胞核，但却存在明显的凋亡现象，影响输注后体内的存活率［4］。国家标准规定悬浮在自体血浆的单采血小板在（22±2）℃振荡保存仅有5d的有效期，造成临床供应不足。现在面临的难题是血小板的保存时间越长越容易发生血小板的储存损伤，血小板不断激活，释放一系列炎性因子，并引起血小板凋亡，其功能和体内存活率大大降低，影响临床治疗效果，甚至输注无效［1］。

血小板在活化时可分泌和表达一系列特异性蛋白，特别是血小板膜表面糖蛋白CD62p，它是血小板a颗粒膜蛋白，在静息血小板中CD62p仅分布于a颗粒膜上，血小板活化时a颗粒膜蛋白快速与质膜融合并在血小板表面持久表达，与中性粒细胞、T细胞、树突状细胞和单核细胞膜上的CD62p糖蛋白配体1结合，驱动淋巴细胞亚群的迁移与锚定，它是目前最具特性的血小板活化分子标志物［3］。有研究发现，血小板膜表面糖蛋白CD62p的高表达可能与血小板在体内循环中被快速清除有关［5］。Holme等［6］认为CD62P表达＜30%时血小板体内活力较好，CD62p表达＞60%时其体内活力极低。本研究观察到：3组CD62p表达率都是随着时间的延长逐渐增加，1～3d时实验Ⅰ组和实验Ⅱ组的CD62p表达率与对照组差别不大，而5～7d时对照组CD62p表达最低，实验Ⅰ组次之，实验Ⅱ组最大（但3组CD62p表达率均＜60%），这提示血小板悬浮在血小板添加液比悬浮于自身血浆中可能更容易激活，其原因目前尚不清楚，推测可能与血浆中含有激活抑制因子有关［7］；但在相同血小板添加液中贮存血小板的实验Ⅰ组（10℃）CD62p表达率低于实验Ⅱ组（22℃），说明低温保存对血小板的活化有保护作用。血小板保存期间不仅CD62p表达增加，而且还会释放一些细胞因子如转化生长因子B1、白细胞介素6、白细胞介素1B等，这些细胞因子可能导致无抗体调节的输血反应［8］。单采血小板的活化程度和保存期间细胞因子的释放是由血小板添加液的性质和保存温度等综合因素决定的［7］。本研究用65%血小板添加液混合35%血浆来保存血小板，观察7 d内血小板的体外功能。血小板添加液中海藻糖能很好地抑制寒冷导致的血小板变形聚集，是一种非常有研究潜力的低温血小板保护剂［9］，少量的血浆可以提供血小板代谢所需要的底物。用血小板添加液混合血浆保存血小板，可以降低血浆使用比例，还可以降低血液传染病毒和其他病原体的可能，但对血小板的激活抑制作用稍差于血浆保存的对照组，在这方面仍有待于研究改进。

细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，是一种主动的、程序性的由基因控制的细胞自主性死亡方式。越来越多的证据表明，线粒体是凋亡的执行者，是细胞凋亡调控的活动中心，所以线粒体是参与细胞凋亡过程的一种重要细胞器，线粒体外膜的高通透性使得线粒体内外膜间隙内的环境与胞质中的环境几乎相似。与外膜不同的是，其内膜的蛋白质／脂质比较高，心磷脂的含量同样较高，但胆固醇及其缺乏，这就形成了线粒体内膜对离子的不可渗透性，即内膜通透性屏障（不能通过相对分子质量＞15 000的物质）。在氧化呼吸过程中线粒体形成横跨线粒体内膜的跨膜电位△Ψm，而△Ψm的变化与细胞线粒体内膜通透性密切相关。有研究报道许多生理或非生理因素诱导的细胞凋亡均存在△Ψm降低，凋亡可能是导致库存血小板失活的重要因素，而温度又是血小板凋亡的影响因素［3］。线粒体△Ψm去极化是血小板凋亡的早期表现和特征性改变。本研究分别在10℃及22℃左右的温度保存血小板7d，观察△Ψm去极化的情况，试图揭示低温对血小板凋亡的影响，结果发现随着储存时间的延长，血小板的早期凋亡率显著增加。实验Ⅰ组与实验Ⅱ组的保存液相同，但温度有所不同，与实验Ⅱ组［（22±2）℃］相比，实验Ⅰ组（10℃）储存的血小板的凋亡程度最低，表明10℃低温对血小板起到了很好的保护作用。

本研究初步揭示了血小板在血小板添加液及低温条件下体外保存时的活化和凋亡情况，为选择合适的血小板保存液和保存温度提供了初步依据，随着血小板保护剂和保存条件的深入研究，将会更加有效地抑制血小板的活化和凋亡，血小板的保存时间将会有效延长。

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