黄芪多糖对环磷酰胺致大鼠毒性的保护作用

刘晓凤 姜顺军 梁峰华

(1广州医科大学附属肿瘤医院药学部，广东 广州 510095; 2广州医科大学第一附属医院药学部，广东 广州 510120)

·论著·

黄芪多糖对环磷酰胺致大鼠毒性的保护作用

刘晓凤1姜顺军2梁峰华2

(1广州医科大学附属肿瘤医院药学部，广东 广州 510095;2广州医科大学第一附属医院药学部，广东 广州 510120)

目的:研究黄芪多糖(APS)对大鼠原代培养肝细胞抗氧化能力的影响作用。方法:采用“二步灌流法”制备大鼠原代肝细胞, 给予40 μmol/L的环磷酰胺造成脂质过氧化模型, 然后给予三剂量(50、100及150 μmol/L)的黄芪多糖, 对照组给予相同体积的PBS, 继续培养24 h, 测定培养基上清生化、细胞内氧化及抗氧化指标, 并评价黄芪多糖对环磷酰胺致毒性的保护作用。结果:相对于对照组, 黄芪多糖各剂量组转氨酶(ALT, AST)及丙二醛(MDA)含量均明显下降(P<0.05),超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均明显升高(P<0.05),且呈剂量依赖效应。结论:黄芪多糖对环磷酰胺引起的大鼠肝细胞脂质过氧化有一定的抑制作用。

黄芪多糖;环磷酰胺;脂质过氧化;大鼠原代肝细胞

黄芪多糖 (astragalus polysaccharides, APS) 是黄芪的主要生物活性成分, 现代医学发现其药理作用甚广, 具有抗病毒、 抗肿瘤、 抗衰老、 抗辐射、 抗应激、抗氧化等多种药理功效[1], 临床上已经用于治疗肝炎、肿瘤等疾病, 其在治疗肿瘤方面可以提高机体免疫力, 和其他化疗药联合使用时可以降低其毒副反应, 同时增强其抗肿瘤作用。APS已成为当前最重要、应用最广泛的中药提取物之一, 关于APS药理功效的研究也是当前研究的热点。

环磷酰胺在某些肿瘤及免疫性疾病的治疗中有不可替代的作用, 但由于其毒副反应明显限制了它的应用。前期本研究中心采用大鼠原代培养肝细胞, 成功建立了环磷酰胺致体外肝细胞脂质过氧化的模型, 为快速筛选拮抗环磷酰胺毒副作用的天然活性物质的研究提供了重要工具。有文献报道[2, 3], APS具有保肝护肝, 抑制肝纤维化形成的作用, 且有临床研究表明[4], APS具有显著增强抗氧化能力、防止脂质过氧化的药理作用, 故APS有可能通过提高肝细胞的抗氧化能力达到保肝护肝的作用。目前尚未见APS能否拮抗环磷酰胺引起肝细胞脂质过氧化作用的报道, 故采用该细胞模型对APS的抗氧化作用进行研究, 将对临床安全有效使用环磷酰胺, 降低其毒副作用具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠, SPF级, 雌雄兼用, 体质量200～220 g, 广东省实验动物中心提供。

1.2 药品及试剂

黄芪多糖(天津赛诺制药有限公司提供, 批号为091101), 环磷酰胺(有限公司提供, 批号为20100902), 胎牛血清(杭州四季青), RPMI 1640(GIBCO公司), 台盼蓝液, 促肝细胞生长因子, 地塞米松, BCA蛋白测定试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司), 丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(南京建成生物工程公司)。

1.3 仪器与设备

手术器械、移液器、紫外分光光度计(上海，UV752N)、分析天平、恒温水浴锅、便携式离心机。

1.4 肝细胞悬液制备

采用Seglen二步灌流法制备肝细胞悬液, 采用0.4%台盼蓝染色计算肝细胞活率。

1.5 肝细胞原代培养及脂质过氧化模型建立

将活力在90%以上的肝细胞以1×106个/mL分别接种于铺有鼠尾胶原的6孔培养板中,37℃、5%CO2条件下, 以含20%胎牛血清、20 μg/mL促肝细胞生长因子及5 μg/mL地塞米松的1 640培养基培养。10 h细胞贴壁后首次换液, 2 d后换液给予40 μmol/L环磷酰胺共孵育24 h。

1.6 细胞分组及给药

取细胞生长状态良好的4块6孔板, 随机分为4组, 给药组分别加入含50、100及150 μmol/L APS, 每个浓度剂量平行加入6孔，记为A、B、C组。 模型对照组只加入相同体积的PBS, 共孵育24 h。

1.7 肝细胞功能检测

分别取6孔板培养基上清适量, 按照试剂盒方法分别测定各组ALT和AST的浓度;弃去上清, 采用细胞刮匙刮离细胞, 于2000 r/min离心5 min后收集细胞。加入1 mL PBS重悬细胞, 通过反复冻融, 以使细胞破坏并放出细胞内成分,于3 000 r/min离心20 min, 收集上清, 采用BCA蛋白试剂盒测定总蛋白含量, 按照试剂盒方法测定MDA含量和SOD, GSH-Px活性。

1.8 数据统计

2 结 果

2.1 APS对培养基上清转氨酶的影响

如表1所示, 各组别上清中的ALT和AST浓度随着APS剂量的增加而下降, 且与正常对照组比较, 差异有统计学意义(P<0.05)。

组别剂量(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)模型对照组00.87±0.161.75±0.28A500.63±0.09*1.50±0.14*B1000.45±0.13*1.29±0.08*C1500.33±0.04*1.07±0.12*

注：与模型对照组比较,*P<0.05。

2.2 APS对肝细胞氧化及抗氧化指标的影响

由表2可见, 各剂量组肝细胞MDA含量均较模型对照组降低, 其中A组与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05), B、C两组与对照组相比较有差异有统计学意义(P<0.01);与对照组比较, 各组肝细胞中SOD和GSH-Px水平随着给药剂量增加呈升高趋势, 其中A、B两组与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05), C组与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 APS对细胞MDA, SOD和GSH-Px的影响

注：与模型对照组比较,*P<0.05。

3 讨 论

肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一, 近些年来随着人们生活作息不规律以及环境污染的加剧, 其发病率呈逐年上升的趋势。环磷酰胺作为一种细胞周期非特异性的广谱抗肿瘤药, 在某些肿瘤及免疫性疾病的治疗中有不可替代的作用。由于其具有明显的细胞毒性, 医学界一直在努力寻求天然活性药物与其合用, 以达到既降低其毒副作用, 又增强其抗肿瘤作用的目的。APS作为一种免疫调节剂, 被证实具有多种重要的生物活性, 正日益受到人们的重视和普遍欢迎。有文献表明[5], APS使正常雏鸡血清中GSH-Px、SOD活性显著升高, 并使其MDA显著降低。这表明APS可提高鸡的抗氧化作用, 提示APS提高机体的免疫力可能与调节和平衡体内的氧化和抗氧化系统的功能密切相关。吴小进等[6]的研究表明，APS具有抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用。然而APS的辅助抗肿瘤机制目前尚未完全阐明，仍需进一步深入研究。

本研究采用前期建立的细胞模型, 对APS的体外抗氧化作用进行了研究。结果表明, APS能显著降低肝细胞培养基上清AST和ALT以及肝细胞中MDA的含量, 并显著提高肝细胞中SOD和GSH-Px的活性, 提示APS可通过增强靶器官中GSH-Px和SOD活性提高免疫防御和免疫监视, 在与环磷酰胺合用时, 具有减毒的作用。因此, 在实际临床应用中, 可考虑联合使用以降低环磷酰胺的毒副作用。

本研究为环磷酰胺在肿瘤和其他免疫性疾病防治中的应用提供了新的思路, 也为下一步采用该模型继续筛选其他天然活性产物的工作奠定了基础。

[1] 吕淑华.黄芪多糖抗肿瘤作用研究进展[J].江西中医学院学报, 2009, 21(1):85-87.

[2] 张 欣, 党双锁，程延安，等.大黄素和黄芪多糖对实验性肝损伤大鼠肝脏超微结构的影响[J].西安交通大学学报, 2009, 30(4):502-505.

[3] DANG SS, ZHANG X, JIA XL, et al.Protective effects of emodin and astragalus polysaccharides on chronic hepatic injury in rats [J].Chin Med J, 2008, 121(11):1010-1014.

[4] 卢彦琦, 贺学礼.黄芪化学成分及药理作用综述[J].保定师范专科学校学报, 2004, 17(4):40-41.

[5] 李宏全, 段县平, 马海利，等.黄芪多糖提高鸡抗氧化作用对免疫功能的影响 [J].山西农业大学学报:自然科学版, 2002, 22(1):78-81.

[6] 吴小进,米燕燕,杨 辉，等.黄芪多糖抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导凋亡[J].中华生物医学工程杂志,2014,20(2):106-109.

(本文编辑:王馨)

Protective effect of astragalus polysaccharide on cyclophosphamide-induced toxicity in rats

LiuXiaofeng1,JiangShunjun2,LiangFenghua2

(1DepartmentofPharmacy,CancerCenterofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510095;2DepartmentofPharmacy,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China)

Objective:To investigate the antioxidant effect of astragalus polysaccharides (APS) on primary cultured hepatocytes in rats.Methods:Rat primary cultured hepatocytes were prepared by two-step perfusion method.And the hepatocytes were given 40 μmol/L cyclophosphamide for establishing model of lipid peroxidation, then given three concentrations (50, 100 and 150 μmol/L) of APS.The model group was given the same volume of PBS, and cultured for continuous 24h.The biochemical indicator of the supernatant and oxidant and antioxidant indicators of the cells in the medium were determined.And the protective effect of APS on cyclophosphamide-induced toxicity was evaluated.Results: Compared with the model group, the content of transaminase (ALT, AST) and malonaldehyde (MDA) significantly decreased (P<0.05), and the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) significantly increased (P<0.05), with a dose-dependent effect in each dose group of APS.Conclusion:APS had certain inhibitory effect on cyclophosphamide-induced lipid peroxidation in hepatocytes of rats.

astragalus polysaccharides; cyclophosphamide; lipid peroxidation; rat primary hepatocytes

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.01.003

刘晓凤(1975-)，女，本科,副主任药师。

R285.5

A

2095-9664(2015)01-0009-03

2014-10-20)

研究方向：医院药学。