山羊绒DNA的提取及验证

王玫+任亮+孔平+颜怀玉+肇慧君+杨春光

摘要

提取DNA是利用PCR技术检测纤维的关键技术难点。本文对山羊绒DNA的提取方法进行了试验，并通过PCR扩增的方法进行验证。结果表明：使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 试剂盒，将纤维样品尽量处理成粉末状，并在样品经裂解液处理后先离心除去其中尚未完全溶解的纤维，然后进行PCR扩增是比较有利的，完全能够得到满足PCR扩增要求的DNA样品。

关键词：山羊绒;DNA;提取方法;验证

山羊绒是一种珍贵的动物纤维，山羊绒的价格比绵羊毛、马海毛的价格高出很多倍，一些商家为了牟取利益，将细支绵羊毛、马海毛等混纺产品冠以“纯羊绒”的桂冠，使消费者上当[1]。目前羊绒羊毛纤维普遍采用的鉴别方法是投影仪法、扫描电镜法，其原理为通过纤维的外观形态、微观结构辨别纤维种类，由于主观因素大，准确率不高[2]。利用PCR技术鉴别动物纤维是近年来的研究热点，而DNA的提取是利用PCR技术检测纤维的关键技术难点。

毛发中的DNA主要集中在毛囊细胞中，毛干部分仅含有少量线粒体DNA[3]。在从动物体上采集或脱落的毛发中，绝大多数都带有完整的毛囊[4]。王庆林等研究表明从被毛毛囊细胞中提取DNA的最大缺点是获得的DNA量非常少，如操作不慎，就有可能提取不到DNA[5]。毛干相对于毛囊，其DNA含量更少，几乎所有成分都是角蛋白，但作为动物组织，毛干具有细胞结构，如果提取方法得当仍可以获得一定量的DNA[6]。吴云良通过对细胞的煮沸和冷却，使细胞破裂、蛋白质变性，从而获得用于PCR扩增的模板DNA的法为提取东北虎毛发中DNA[7]。徐怀亮等提出一种快捷、简便、经济、高效、安全、有效的提取藏酋猴毛干中DNA的方法——纳米磁珠法，并指出进行毛发取样时以5～10根较为合适[8]。目前，国内从动物毛皮中提取DNA的方法，主要采用经典的DNA提取技术：蛋白酶K法裂解结合酚-氯仿抽提[9];研究对象主要是一些珍稀动物如小熊猫[10]、鬣羚[11]、麝科动物[12]、扬子鳄[13]等的陈旧毛皮标本。虽然有关毛干DNA提取的报道已屡见不鲜，但由于毛干DNA含量低、髓质层与皮质层中含大量色素不易与DNA分离而抑制PCR扩增等问题[14-15]，常造成DNA提取、纯化困难，导致分子生物学相关研究受到限制，影响下游工作。关于山羊绒DNA提取方面的报道较少，本文对山羊绒DNA提取方法进行了试验与研究，采用PCR扩增的手段对方法的可靠性进行验证。

1    试验材料与仪器

1.1  试剂

试验用水应符合GB/T  6682中一级水的规格，组织和毛发提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa Code.9765），Premix Ex Taq? （Probe qPCR） （TaKaRa Code. RR390A），100%乙醇，DNA Laddar Marker。

1.2  仪器与设备

冰箱：4℃～20℃，天平：感量0.0001g，分析研磨机，剪刀，恒温水浴锅，离心机（12000 rpm），涡旋混合器，微量可调移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL，1.5mL离心管，超净工作台，PCR仪，实时荧光定量PCR仪，电泳装置，凝胶成像仪。

2    试验方法与步骤

2.1  取样

从山羊绒制品的不用部位取样，共取约1 g试样。

2.2  制样

用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再用剪刀尽量剪碎至2 mm以下，再次用分析研磨机混匀。

2.3  DNA的提取

从混匀的样品中称取约5 mg试样，放入2 mL离心管中，每个样平行提取两管，提取步骤严格按照试剂盒说明书进行操作，此处不赘述。提取过程注意如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先12000 rpm离心2分钟，去除杂质之后再进行后续操作。提取试剂盒由宝生物工程（大连）有限公司提供，试剂盒型号TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。

2.4  引物探针信息

本文所用的引物和探针均由TakaRa宝生物工程（大连）有限公司合成，具体见表1。

表1    山羊绒成分荧光定量PCR引物及探针

3    结果与分析

3.1  DNA提取效果

DNA提取结束后对其进行DNA电泳以确保其DNA的提出，具体结果见图1。 由图1可见，提取的DNA扩增条带清晰，提取效果良好。

图1    提取山羊绒DNA电泳图

2μLApplied，1%Agarose;M：DNA Marker λ-Hind III digest;1-2：山羊绒DNA

3.2  引物特异性验证

在优化好的PCR反应条件和反应体系下，以鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、山羊绒、牦牛绒、羊驼毛的DNA为特异性试验对照进行PCR检测。电泳结果显示，仅有山羊绒被扩增出条带，而阴性对照未扩增出条带，证明山羊绒引物的特异性良好，将其应用于PCR方法，山羊绒成分可以从其他纤维中有效地鉴别出来，具体结果见图2。图2所显示的扩增片段大小约是300bp，大小符合所设计的引物片段大小303bp，且阴性对照和其他非山羊绒模板对照均未出现特异性条带。

1   2    3   4    5   6    7   8   M

图2    PCR特异性检测结果

5μL Applied， 3% Agarose，M：100bp DNA Laddar Marker;1：鸭绒PCR产物;2：鹅绒PCR产物;3：绵羊毛PCR产物;4：兔毛PCR产物;5：山羊绒 PCR产物;6：牦牛绒PCR产物;7：羊驼毛PCR产物;8：阴性对照（Negative Control）。

3.3  检测体系及结果

3.3.1  反应体系及反应条件

（1） PCR反应体系

以提取的山羊绒DNA为模板，每次反应均设阴性对照和阳性对照。实时荧光PCR反应体系25 μL，具体见表2。

表2    荧光定量PCR反应体系

注： Negative control反应时，加入RNase free dH2O;Positive反应时，做两个平行样。

（2）反应条件

本试验建立的荧光定量PCR初步反应参数包括预变性、变性、退火延伸三步。实时荧光定量PCR初步反应参数见表3。

表3    荧光定量反应条件参数

ABI 7500 Fast Real Time System荧光定量PCR仪完全封闭操作，仪器可以直接读数，荧光定量PCR荧信号在每一循环延伸步骤完成后收集，并立即显示出结果，可实时观察每一循环收集荧光信号的强度。

3.3.2  检测结果

（1） Ct值及结果判定

在优化好的荧光PCR反应条件和反应体系下，选择鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、山羊绒、牦牛绒、羊驼毛的DNA为特异性试验的对照来进行荧光PCR检测。检测结果显示，仅山羊绒Ct值为26.125，而其他样品及阴性对照无Ct值，Ct值及结果判定见表4。

（2） 荧光PCR检测特异性试验结果

在优化好的荧光PCR反应条件和反应体系下，选择鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、山羊绒、牦牛绒、羊驼毛的DNA为特异性试验的对照来进行荧光PCR检测。检测结果显示，仅山羊绒有扩增曲线，而其他对照以及空白对照均没有扩增曲线，表明本试验设计的特异性引物和探针与山羊基因具有较高同源性，而与其他常见动物物种的基因并没有同源性，该检测方法具较强的特异性。具体结果见图3。

图3    山羊绒DNA荧光PCR结果

4    结论

本文使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 试剂盒提取山羊绒DNA，经检测验证，DNA扩增曲线良好，电泳条带清晰，空白对照是阴性结果，引物对在其他几种动物纤维体系内，包含鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、牦牛绒和羊驼毛，没有扩增。引物探针反应性能和特异性良好，该试剂盒提取山羊绒纤维DNA可以用于山羊绒检测。试验时将纤维样品尽量处理成粉末状，并在样品经裂解液处理后先离心除去其中尚未完全溶解的纤维，然后进行PCR扩增是比较有利的，完全能够得到满足PCR扩增要求的DNA样品。

参考文献：

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（作者单位：辽宁出入境检验检疫局）