PI3K／AKT及MEK／ERK信号通路在肿瘤血管内皮细胞迁移中的作用＊

肖高春，童仕伦，郑勇斌，郝志楠，李盛波

（武汉大学人民医院胃肠外科，湖北武汉430060）

肿瘤的发生、发展过程中存在多个信号通路的异常活化，并参与肿瘤的进展。其中研究较为广泛的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（serine threonine kinase，AKT）与丝裂原细胞外信号调节激酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）／细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路也发现在多种肿瘤中异常活化，且其异常活化可抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞周期的进展，进而促进肿瘤细胞的增殖与生存，在肿瘤中起重要作用，并参与肿瘤的侵袭与转移[1]。近来有研究显示，该信号通路不仅参与肿瘤的进展，同时也影响肿瘤的血管生成。PI3K是一种具有催化活性的细胞内信号蛋白，其可以调控下游的AKT磷酸化水平，二者共同构成PI3K／AKT信号通路[2]，此信号通路可在多种类型细胞迁移过程中发挥调控作用[3-4]。Lelievre等[5]研究表明，PI3K信号通路中的p110亚单位不仅能够调节内皮细胞的迁移和屏障功能，同时对血管形成也有重要作用。且血管内皮细胞中的ras基因持续活化能直接调节PI3K信号通路，诱导肿瘤血管畸变。

MEK／ERK信号通路是将细胞表面受体信号转导至细胞核的关键，控制着细胞多种生理过程，参入细胞的增殖、迁移与分化。内皮细胞在新生血管形成过程中需要MEK／ERK信号通路的激活[6]。有研究发现，ERK和MEK分子期中的一个，都具备有抗新生血管生成的作用，表明MEK／ERK通路中的信号分子能为治疗新生血管相关疾病提供合理的靶向分子[7]。任萱等[8]研究表明，ERK信号分子可能通过抑制内皮细胞的增殖和迁移而影响新生血管的生成。目前以上述两信号通路为靶点的治疗备受关注。但对这两条信号在结肠癌血管内皮细胞迁移中的作用研究尚少见报道，本实验通过PI3K／AKT信号通路抑制剂LY294002，MEK／ERK信号通路抑制剂PD98059，来研究两信号通路在结肠癌血管内皮细胞迁移种的作用及机制，为抗肿瘤新生血管形成治疗提供实验依据，寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）来自武汉大学消化实验室保存，人结肠癌细胞株LOVO（武汉大学保藏中心），PD98059，LY294002购自碧云天公司，胎牛血清购自Gibco公司，DMEM-F12培养基购自Hyclone公司，细胞培养瓶、培养板、Transwell小室购自Corning公司，鼠尾胶购自Sigma公司，倒置相差显微镜日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 实验分为8组，其中PI3K／AKT信号通路干预3组，使用2.50、7.50、15.00μmol／L的LY294002干预内皮细胞的PI3K／AKT信号通路；MEK／ERK信号通路干预3组，使用2.50、7.50、15.00μmol／L的PD98059干预内皮细胞的MEK／ERK信号通路（抑制剂使用浓度依据预实验中确定的两抑制剂的IC50来确定）；含0.10%二甲基亚砜（DMSO）的培养基组（DMSO组用来检测溶解LY294002和PD98059的溶剂DMSO对内皮细胞的功能的影响）；使用DMEM-F12培养基组（DMEM-F12组）作为对照组，每组设一复孔，重复3次。

1.2.2 细胞培养 HUVEC于37℃、5%CO2培养，每2～3天换液1次，当细胞80.00%左右融合时传代培养。

1.2.3 LOVO培养上清液收集 参照文献[9]方法将LOVO细胞用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养，当细胞80%左右融合的时，吸出培养基，PBS清洗2次后，加入5mL无血清的DMEM-F12继续培养，48h后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，-80℃保存备用。

1.2.4 肿瘤血管内皮细胞制备 取对数期生长的HUVEC，用含体积分数为50%LOVO细胞上清液的DMEM-F12培养，当细胞80%左右融合时收集细胞，即为肿瘤源性血管内皮细（Td-EC）[9]，具有肿瘤血管的特性，并可以传代培养。

1.2.5 细胞划痕修复实验 参照文献[10]方法取对数期生长的肿瘤血管内皮细胞悬液3.50×105个／孔，接种于预先做好刻度的6孔板（在6孔板背面每隔0.50cm做一刻度线，共5条刻度线），轻轻震荡细胞培养板，使细胞分散均匀，待细胞80%左右融合时换成无血清培养基继续培养24h，同步化处理。在各孔内用200μL枪头做一垂直于刻度线的划痕，划去细胞并用PBS洗除漂浮细胞后。各组按前述分组处理，再继续培养细胞30h后分别测量5条标记线处的最大迁移距离，取5个位点的平均值作为一次测量值。细胞迁移距离＝测量距离（0h）-测量距离（30h），以μm作为计量单位。

1.2.6 定向迁移实验 取12孔板每孔放两个8mm×8mm的克隆环，紧密排列，固定于板底，两孔内分别加入2.5×104个Lovo细胞和对数期生长的肿瘤血管内皮细胞，待肿瘤血管内皮细胞80%左右融合时，用无血清培养基同步化处理24h后，吸出培养基，PBS清洗后，各组内皮细胞环内按前述分组处理。LOVO细胞继续用含10%的胎牛血清培养基。12h后吸出两克隆环内的液体，并取出克隆环，PBS清洗，各孔内加入2.5mL DMEM-F12完全培养基。以此时为0h，利用两细胞团边缘细胞迁移距离为测量方法，再培养30h后测量两细胞团边缘间最近细胞间距离，细胞定向迁移距离＝测量距离（0 h）-测量距离（30h），以μm作为计量单位。

1.2.7 Transwell迁移实验 实验中采用6.50mm 直 径，10 μm厚度，8μm孔径的聚碳酸酯多孔滤膜。将Transwell小室用1mg／mL的鼠尾胶包被。取200μL Sigma鼠尾胶原蛋白（5mg／mL）加入置入冰浴的离心管中，加入690μL H2O。然后加入到12μL 0.10mol／L NaOH中立即混匀，再加入100 μL 10×PBS培养液，混匀后立即以每孔50μL加入Transwell小室，轻轻震荡，使其均匀平铺在小室膜上，将小室室温（25℃左右）下放置20min待胶凝固后，转移到培养箱内。使用前加入200μL DMEM-F12培养液预平衡。取各组处理后的对数期生长的肿瘤血管内皮细胞2×105个与无血清培养基200μL加入上室，下室内加入600μL含10%的胎牛血清的培养基。培养24h后吸出培养基，用4%的多聚甲醛固定20min，自然晾干后用0.20%结晶紫染色15min，用脱脂棉擦除小室上表面的细胞，PBS清洗后，取小室放于载玻片上，在倒置相差显微镜（×100倍）上取上、下、左、右、中五个视野拍片计数，计算5个视野的平均值为穿膜细胞数。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料用±s表示，组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组间细胞划痕修复实验检测比较 细胞划痕修复实验检测PI3K／AKT及MEK／ERK信号通路在肿瘤血管内皮细胞迁移中的作用，结果显示，DMSO组与DMEM-F12组比较，迁移距离差异无统计学意义（P＞0.05），小剂量DMSO对肿瘤血管内皮细胞的水平迁移功能无影响；PD98059、LY294002处理组细胞迁移受抑制，迁移距离明显小于DMEM-F12组（P＜0.05），且随着抑制剂浓度的增大，抑制越明显，两抑制剂对肿瘤血管内皮细胞迁移的影响有浓度相关性；两抑制剂之间比较，同等浓度的LY294002对细胞水平迁移的影响比PD98059明显，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。LY294002对肿瘤血管内皮细胞迁移能力的影响较PD98059强，且随着抑制剂浓度增大，细胞迁移距离越短，同浓度的抑制剂LY294002组较PD98059组间距更大，见图1A、B。

2.2 组间细胞定向迁移实验检测比较 定向迁移实验检测PI3K／AKT及MEK／ERK信号通路在肿瘤血管内皮细胞迁移中的作用，结果显示，DMSO组与DMEM-F12组迁移距离比较，差异无统计学意义（P＞0.05），小剂量DMSO对肿瘤血管内皮细胞的定向迁移功能无影响；PD98059、LY294002处理组肿瘤血管内皮细胞迁移受抑制，与DMEM-F12组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且随着抑制剂浓度的增大，抑制越明显，各亚组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两抑制剂对肿瘤血管内皮细胞迁移的影响均与浓度呈正相关；两抑制剂间比较，同等浓度的LY294002对肿瘤血管内皮细胞定向迁移的抑制作用较PD98059强，二者间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。且随抑制剂浓度的增大，两细胞团间的距离也越大，同等浓度的抑制剂，LY294002组较PD98059组间距大，见图1C、D。

图1 PD98059与LY294002处理后30h细胞刊痕、定向迁移及细胞迁移图像

2.3 组间细胞Transwell迁移实验检测比较 Transwell迁移实验检测PI3K／AKT及MEK／ERK信号通路在肿瘤血管内皮细胞迁移作用，结果显示，DMSO组与DMEM-F12组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），小剂量DMSO对肿瘤血管内皮细胞垂直迁移无影响；PD98059、LY294002处理组细胞迁移数量明显小于DMEM-F12组，差异有统计学意义（P＜0.05），两抑制剂能抑制肿瘤血管内皮细胞垂直迁移；随着抑制剂浓度的增大，迁移到膜下的细胞数逐渐减少，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），抑制剂对细胞迁移能力的影响与浓度呈正相关；两抑制剂间比较，同等浓度的LY294002处理组穿膜细胞数较PD98059处理组少，二者比较差异有统计学意义（P＜0.05），LY294002对细胞垂直迁移的抑制作用较PD98059强（表1）。随着抑制剂浓度增大，穿膜细胞数逐渐减少，同等浓度的抑制剂LY294002组较PD98059组穿膜细胞少，见图1E、F。

表1 组间细胞划痕修复及定向迁移距离等比较（±s）

表1 组间细胞划痕修复及定向迁移距离等比较（±s）

a：P＜0.05，与DMEM-F12、DMSO组比较；b：P＜0.05，与PD98059组相同剂量比较；c：P＜0.05，与同组2.50μmol／L比较；d：P＜0.05，与同组7.50μmol／L比较。

366.24±13.22 630.60±19.55 472.33±11.83 DMSO组 359.96±14.26 638.76±23.88 475.67±17.75 LY294002组2.50μmol／L 262.14±23.63ab 474.30±14.88ab 331.50±17.52ab 7.50μmol／L 208.41±23.08abc 385.11±16.80abc 277.17±13.96abc 15.00μmol／L 124.12±27.44abd 311.62±20.69abd 219.50±20.82abd PD98059组2.50μmol／L 295.44±14.10a 515.41±20.81a 372.00±15.71a 7.50μmol／L 256.00±15.16ac 440.89±18.62ac 313.00±24.29ac 15.00μmol／L 204.19±15.01ad 386.18±16.72ad 271.12±16.10组别 划痕迁移距离 定向迁移距离 迁移细胞数DMEM-F12组ad

3 讨论

结肠癌是消化道常见恶性肿瘤，在中国消化道肿瘤中排第3位，且其发病率近年有明显增高趋势。结肠癌的治疗，目前以手术治疗作为首选，辅以化疗、内分泌治疗、免疫治疗、靶向治疗、中药治疗等。虽然结肠癌的治疗方法很多，但结肠癌的总体治愈率近年来并没有显著的提高，而随着对结肠癌的发生、浸润、转移的深入研究，发现无论是在转移的起始还是终末阶段，血管生成均发挥着重要作用。因肿瘤的生长分为无血管期和血管期，当肿瘤体积超过1mm3时肿瘤即进入血管期，其生长必需依靠新生血管维持营养供给和排泄代谢产物。如果没有新生血管生成，肿瘤就会保持休眠状态甚至发生退化。然而肿瘤血管的生成是一持续、无控性过程，这种持续无规则的血管形成可以促进肿瘤的生长、浸润和转移[11]。多条信号通路涉及到该过程，有研究发现，Notch信号途径在血管发育的过程中起着重要作用，可直接影响血管重构、血管平滑肌细胞的分化、血管稳定性等，血管生成素及其受体、血管内皮生长因子（VEGF）／VEEFR、成纤维细胞生长因子及其受体、血小板源生长因子及其受体等信号通路在肿瘤的血管形成也起重要作用[12-13]。

本实验发现，PI3K／AKT和MEK／ERK信号通路参与结肠癌血管内皮细胞迁移过程。抑制两信号通路后，内皮细胞的水平、垂直和定向迁移均受抑制，且与浓度呈正相关。细胞迁移是一涉及多步骤复杂过程，包括细胞极化，伪足生成，伪足与细胞外基质黏附，细胞体收缩，细胞尾端和周期基质解离，最终向前运动。VEGF是影响内皮细胞迁移的重要因子，Luangdilok等[14]通过对头颈部鳞状细胞癌研究发现，抑制两信号通路能抑制肿瘤细胞VEGF的表达，从而抑制内皮细胞的迁移。Karar等[15]发现，突变的ras可以通过激活肿瘤细胞中的PI3K／AKT增加VEGF的分泌，来诱导内皮细胞向肿瘤细胞定向迁移。Chung等[16]发现，抑制两信号通路都可以抑制由芝麻素诱导的ERK、AKT、eNOS和p38MAPK磷酸化，从而抑制内皮细胞的迁移。以上资料均证明，PI3K／AKT和MEK／ERK信号通路参与了细胞迁移过程，并与本研究的结果一致，抑制两信号通路能够抑制内皮细胞的迁移。

PI3K／AKT和MEK／ERK两信号通路对细胞迁移的作用也不完全相同，同等浓度LY294002较PD98059对内皮细胞迁移的影响更明显。有研究发现，抑制两信号通路均能抑制VEGFA的表达，但抑制MEK／ERK通路能抑制VEGFC的表达，抑制PI3K／AKT通路，VEGFC的表达没有发生改变[15]。Yoshizuka等[17]发现，抑制p38可以可以减弱VEGF诱导的内皮细胞迁移，PD98059可以抑制VEGF诱导的p38和ERK1／2的活性，但不影响PRAK。而p38可以激活PRAK诱导内细胞迁移。以上研究显示，两信号通路对VEGF的表达和内皮细胞迁移的影响不一样。缺氧可以刺激肿瘤细胞增加VEGF分泌，从而激活Ras-PI3K／AKT通路，研究表明活化的PI3K可以通过与膜上的磷脂和相邻的Ras结合发生变构效应，使细胞发生极化，确定肿瘤血管内皮细胞迁移的方向，PI3K／AKT活化后可以进而激活Rac、Rho，调节细胞伪足生成、细胞收缩等，RhoA和Rac通过Rho-激酶和PAK调节细胞尾部解聚，使细胞迁移[18]。VEGF也可以激活Ras-Raf-MEK／ERK信号通路，激活的ERK通过肌球蛋白轻链激酶调节细胞突触和促进细胞局部黏附，另一方面其也可以通过钙蛋白酶促进黏附解聚[19]。说明两信号通路均参与细胞定向迁移，但在迁移过程的作用不同。细胞迁移的速率决定于伪足突出和黏附释放的速度。快速移动的细胞移动的速率决定于伪足突出的速率，而缓慢移动的细胞移动速度决定于黏附释放的速度。伪足突出的速率是决定着细胞移动速度的关键，而PI3K参与细胞极化和伪足生成。细胞的化学趋向性决定着细胞迁移的方向，本实验中抑制PI3K／AKT信号通路对肿瘤血管内皮细胞定向迁移及垂直迁移的影响比MEK／ERK信号通路明显，说明在结肠癌血管内皮细胞定向迁移和垂直迁移过程中PI3K／AKT决定着细胞迁移的速率，这与两信号通路的在细胞迁移中的作用机制相符。ERK主要通过参与细胞黏附和解聚，调节细胞迁移速率。在细胞划痕修复试验中，也表现为PI3K／AKT信号通路对肿瘤血管内皮细胞迁移影响比MEK／ERK信号通路明显，说明两信号通路对细胞黏附和解聚的调节也有差异。由此本研究推测联合应用两抑制剂可能协同增强抑制效应，这种抑制效应在细胞定向迁移和趋化迁移中可能表现更明显。

综上所述，肿瘤血管的生成是一涉及到多条信号通路，多步骤复杂的过程。本研究发现，抑制PI3K／AKT和MEK／ERK信号通路均能抑制结肠癌血管内皮细胞的水平、垂直和定向迁移，且与抑制剂浓度呈正相关；抑制PI3K／AKT信号通路对内皮细胞迁移的影响比MEK／ERK信号通路明显，联合应用两抑制剂可能协同增强抑制作用。对PI3K／AKT和MEK／ERK的表达及其在内皮细胞不定向迁移、增殖、管道形成中的作用有待进一步的研究。

[1] 李月飞.PI3K／Akt／mTOR信号传导通路在恶性肿瘤中的研究进展[J].中国医药指南，2013，11（36）：358.

[2] Williams R，Berndt A，Miller S，et al.Form and exibility in phos-phoinositide 3-kinases[J].Biochem Soc Tran，2009，37（4）：615-626.

[3] Xiong W，Cheng BH，Jia SB，et al.Involvement of the PI3K／Akt signaling pathway in platelet-derived growth factor-induced migra-tion of human lens epithelial cells[J].Curr Eye Res，2010，35（5）：389-401.

[4] Dasari VR，Kaur K，Velpula KK，et al.Upregulation of PTEN in glioma cells by cord blood mesenchymal stem cells inhibits migrationvia downregulation of the PI3K／Akt pathway[J].PLos One，2010，5（4）：e10350.

[5] Lelievre E，Bourbon PM，Duan LJ，et al.Deficiency in the p110alpha subunit of PI3Kresults in diminished Tie2expression and Tie2（-／-）-like vascular defects in mice[J].Blood，2005，105（10）：3935-3938.

[6] Lee SJ，Namkoong S，Kim YM，et al.Fractalkine stimulates angiogenesis by activating the Raf-1／MEK／ERK-and PI3K／Akt／eNOS-dependent signal pathways[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291（6）：2836-2846.

[7] Bullard LE，Qi X，Penn JS.Role for extracellular signalre-sponsive kinase-1and-2in retinal angiogenesis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（4）：1722-1731.

[8] 任萱，林莉萍，丁健.微管抑制剂C9抑制新生血管生成的作用机制[J].中国新药杂志，2011，20（17）：1703-1710.

[9] 向邦德，吕明德，黄洁夫，等.诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究[J].中山大学学报：医学科学版，2005，26（3）：354-357.

[10] 唐小飞.PI3K抑制剂对三阴性乳腺癌细胞增殖及迁移的影响[D].重庆：重庆医科大学，2013.

[11] Paku S，Kopper L，Nagy P.Development of the vasculature in“pushing-type”liver metastases of an experimental colorectal cancer[J].Int J Cancer，2005，115（6）：893-902.

[12] 王莉，刘向东，赵星成，等.Notch信号途径在血管形成和内皮细胞中的作用[J].细胞与分子免疫学杂志，2012，28（8）：39-41.

[13] 胡明明，胡瑛，李宝兰.肿瘤中血管生成信号通路相关药物临床转化研究现状[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2014，21（1）：86-94.

[14] Luangdilok S，Box C，Harrington K，et al.MAPK and PI3Ksignalling differentially regulate angiogenic and lymphangiogenic cytokine secretion in squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Eur J Cancer，2011，47（4），520-529.

[15] Karar J，Maity A.PI3K／AKT／mTOR pathway in angiogenesis[J].Front Mol Neurosci，2011，4（51）：1-8.

[16] Chung BH，Lee JJ，Kim JD，et al.Angiogenic activity of sesamin through the activation of multiple signal pathways[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，391（1）：254-260.

[17] Yoshizuka N，Chen RM，Xu Z，et al.A novel function of p38-regulated／activated kinase in endothelial cell migration and tumor angiogenesis[J].Mol Cell Biol，2012，32（3），606-618.

[18] 毛斌，刘肖珩，赖怡，等.PI3K对IL-8／Rac1信号通路介导的内皮细胞迁移的影响[J].国际生物医学工程杂志，2010，33（3）：134-137，151.

[19] 王彦敏.血管生成因子VEGF研究进展[J].河北医药，2010，32（11）：1456-1458.