筛选调控黄芪次生代谢产物黄酮含量诱导子的研究

孙丽英，郭春乐，闫嵩，任伟超，刘振鹏，张开雪，马伟，刘秀波

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

诱导子能引起植物抗病生理过程，诱导植物产生植保素并引起植物过敏反应的因子，能够开启代谢过程中酶的活性，因而能够增加次生代谢物的含量，有时甚至可以诱导出新的化合物［1-2］。从目前的研究来看，诱导子对次生代谢途径的调控具有专一性，和对同一代谢途径调控的诱导子多样性。如真菌诱导子可快速激活百脉根的毛状根中的苯丙氨酸氨基裂解酶，合成异黄酮化合物，而对其它无直接关系的酶没有明显的作用;也有研究者发现用12种不同真菌菌丝体匀浆对长春花细胞悬浮培养，其吲哚生物碱含量和对照组比较均明显提高［3-4］。无土栽培在过去几十年的全世界农业生产过程中因其具有无公害生产的环境优势越来越受到欢迎，因而也成为诱导转化最佳载体。

1 材料方法

1.1 试验材料

本试验所用膜荚黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)种子，由黑龙江中医药大学提供。在黑龙江中医药大学药用植物园日光温室内无土栽培培养，营养液采用Hoagland＆Aunon全营养液，光照强度2000～2500Lux，日温25～28℃，夜温17～20℃，相对湿度60%～80%。黄芪苗期无土栽培装置已申请实用新型专利，专利号:ZL201220490816.3。用于试验的黄芪苗龄35天，苗高15cm，七片真叶。处理采样后，105℃烘干0.5h杀青，80℃烘至恒重，利用球磨机1600转20min粉碎，用于待测成分的提取。黄芪黄酮的含量测定采用722型数显可见分光光度计。

1.2 试验方法

本试验采用L24(6×4×23)不等水平正交追加试验设计，利用SPASS软件进行正交试验设计，因素水平见表1。

表1 试验因素水平表

处理后对各次试验的黄芪植株根、茎、叶的黄酮含量进行测量计算，具体方法如下。

1.2.1 黄酮含量测定［5-6］

对照品溶液的制备:精密称取对照品芦丁0.998mg，置10mL容量瓶中，加30%乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀制成标准溶液。

标准曲线的制备:用移液器精密量取对照品溶液0、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分别置1.5mL离心管，分别加入5%亚硝酸钠0.03mL，混匀放置6min，加入10%硝酸铝溶液0.03mL，混匀放置6min，加入氢氧化钠溶液0.4mL，分别用30%的乙醇定容至1ml，混匀放置15min，在510nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，Y=1.222X+0.0075，R2=0.9999。

黄酮提取方法:5g实验样品，20倍体积的70%乙醇室温浸提10h，融化后离心20min，取两份适量上清液挥干，用30%乙醇定容，充分溶解离心5min，取上清液做为待测样品。

样品黄酮含量的测定:用移液器精密量取两份待测样品0.54mL，分别置于1.5ml离心管中，其中一管按标准曲线的制备，依次加入显色剂，另一管则加入和显色剂等体积的水做空白对照，显色后12000rpm离心5min，上机比色测定吸光度，根据标准曲线计算样品黄酮含量。

1.2.2 数据处理

采用SPASS软件及Microsoft Excel软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 黄酮含量方差分析结果

将经各个处理组合处理完毕后测得的黄芪植株根、茎、叶的黄酮含量数据进行方差分析，结果如表2。

从各因素对黄芪黄酮含量影响的方差分析表2可以看出，诱导因子种类处理因素对黄芪根、茎的黄芪黄酮含量影响有极显著差异，对黄芪叶黄酮含量影响有显著差异;诱导子处理时间因素对黄芪根、茎、叶黄酮含影响存在极显著差异;诱导子处理部位因素对黄芪根黄酮含量的影响未达到显著水平，对黄芪黄酮苷含量的影响达到了显著水平，对黄芪叶黄酮含量的影响达到了显著水平，也就是诱导子进行地下部位处理的黄芪根黄酮含量和诱导子进行地上部位处理的黄芪根黄酮含量之间差异不显著，诱导子进行地下部位处理的黄芪茎黄酮含量显著高于诱导子进行地上部位处理的黄芪茎黄酮含量，诱导子进行地下部位处理的黄芪叶黄酮含量极显著高于诱导子进行地上部位处理的黄芪叶黄酮含量。

表2 黄芪黄酮含量方差分析

2.2 黄酮含量多重比较结果分析

2.2.1 诱导因子的多重比较

将各诱导子处理种类因素对黄芪黄酮含量影响的数据结果做进一步的单因素多重比较，对叶的黄酮含量影响的多重比较结果如表3，对茎黄酮含量影响的多重比较结果见表4，对根黄酮含量影响的多重比较结果见表5。

表3 叶中A因素各水平多重比较

从表3中可以看出，诱导子因素中的硝酸银、水溶液处理水平的黄芪叶黄酮含量显著高于吐温、内生菌发酵液处理水平的黄芪叶黄酮的含量;硝酸银、水、茉莉酸甲酯、土豆培养基、水杨酸溶液处理水平之间的黄芪叶黄酮含量无明显差异;茉莉酸甲酯、土豆培养基、水杨酸、吐温、内生菌发酵液处理水平之间的黄芪叶黄酮含无显著差异。

表4 茎中A因素各水平多重比较

从表4中可以看出，诱导子处理种类因素中硝酸银溶液处理水平的黄芪茎黄酮含量显著高于土豆培养基、茉莉酸甲酯、水、吐温、内生菌发酵液、水杨酸溶液处理水平的黄芪茎黄酮的含量;土豆培养基、茉莉酸甲酯溶液处理水平的黄芪茎黄酮的含量显著高于内生菌发酵液、水杨酸溶液处理水平的黄芪茎黄酮含量，土豆培养基、茉莉酸甲酯、水、吐温溶液处理水平之间的黄芪茎黄酮含无显著差异;水、吐温溶液处理水平的黄芪茎黄酮含量显著高于水杨酸溶液处理水平黄芪茎黄酮的含量，水、吐温、内生菌发酵液处理水平之间的黄芪茎黄酮含无显著差异;内生菌发酵液和水杨酸溶液处理水平之间的黄芪茎黄酮含量无显著差异。

表5 根中A因素各水平多重比较

从表5中可以看出，诱导子处理种类因素中硝酸银溶液处理水平的黄芪根黄酮含量显著高于吐温、土豆培养基、水杨酸、茉莉酸甲酯、内生菌发酵液、水溶液处理水平黄芪根黄酮的含量;吐温、土豆培养基、水杨酸、茉莉酸甲酯溶液处理水平的黄芪根黄酮含量显著高于水溶液处理水平的黄芪根黄酮的含量，吐温、土豆培养基、水杨酸、茉莉酸甲酯、内生菌发酵液处理水平之间的黄芪根黄酮含无显著差异;内生菌发酵液和水溶液处理水平之间的黄芪根黄酮含量无显著差异。

综上，从诱导子处理种类因素对黄芪黄酮含量影响的多重比较结果来看，对黄芪根、茎、叶黄酮影响的最佳处理水平是均是硝酸银溶液。

2.2.2 时间因素的多重比较

将各诱导子处理时间因素对黄芪黄酮含量影响的数据结果做进一步的单因素多重比较，对叶的黄酮含量影响的多重比较结果如表6，对茎黄酮含量影响的多重比较结果见表7，对根黄酮含量影响的多重比较结果见表8。

表6 叶中B因素各水平多重比较

从表6中可以看出，诱导子处理时间因素中12天、0天处理水平的黄芪叶黄酮含量显著高于3天、9天、6天处理水平黄芪叶黄酮的含量，12天、0天、3天处理水平之间的黄芪叶黄酮含量无显著差异;3天处理水平的黄芪叶黄酮含量显著高于6天处理水平的黄芪叶黄酮的含量，3天、9天处理水平之间的黄芪叶黄酮含无显著差异;6天和9天处理水平之间的黄芪叶黄酮含量无显著差异。

表7 茎中B因素各水平多重比较

从表7中可以看出，诱导子处理时间因素的12天处理水平的黄芪茎黄酮含量显著高于6天、9天、3天、0天处理水平黄芪茎黄酮的含量;6d处理水平的黄芪茎黄酮含量显著高于3天、0天天处理水平的黄芪茎黄酮的含量，6天、9天处理水平之间的黄芪茎黄酮含量无显著差异;9天、3天处理水平的黄芪茎黄酮含量显著高于0天处理水平的黄芪茎黄酮的含量，9天、3天处理水平之间的黄芪茎黄酮含无显著差异。

表8 根中B因素各水平多重比较

从表8中可以看出，诱导子处理时间因素的9天处理水平的黄芪根黄酮含量显著高于3天、6天、12天、0天处理水平的黄芪根黄酮的含量;3天、6天处理水平的黄芪根黄酮含量显著高于12天、0天处理水平的黄芪根黄酮含量，3天、6天处理水平之间的黄芪根黄酮含量无显著差异;12天处理水平的黄芪根黄酮含量显著高于0天处理水平的黄芪根黄酮的含量。

综上，从诱导子处理时间因素对黄芪黄酮含量影响的多重比较结果来看，对黄芪根黄酮含量影响最佳处理水平是9天;对黄芪茎黄酮含量影响的最佳处理水平是12天;对黄芪叶黄酮含量影响的最佳处理水平是12天。

3 结论

从正交试验进行方差分析和多重比较分析结果来看，影响黄芪叶和茎黄酮含量的最佳处理组合是A4B5C2，也就是硝酸银溶液进行地下部位处理12天的处理组合;影响黄芪根黄酮含量的最佳处理组合是A4B4C2，也就是硝酸银溶液进行地下部位处理9天的处理组合。

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