不同培养液对鼠胚在新建试管婴儿实验室中体外发育的影响

饶金鹏 刘青 钱小红 魏凯 陈剑 金敏 金帆

不同培养液对鼠胚在新建试管婴儿实验室中体外发育的影响

饶金鹏 刘青 钱小红 魏凯 陈剑 金敏 金帆

目的利用三种不同的培养液EBSS(SIGMA系列), G1和G2(Vitrolife系列), Quinn’s1026和Quinn’s1029(SAGE系列)对昆明系小白鼠胚胎进行体外培养, 以对新建IVF实验室进行评估。方法取7周龄的昆明白雌性小鼠, 用人绝经期促性腺激素(HMG)10 IU促排卵,48 h后注射人绒毛促性腺激素(HCG)10 IU促卵泡成熟, 同时与雄性小鼠1：1合笼, 再经过48 h后获取形态正常的2细胞鼠胚。将胚胎分成三组, A组使用EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)培养液, B组使用G1和G2培养液, C组使用Quinn’s1026和Quinn’s1029培养液, 三种培养液均添加10％人血清白蛋白。分析对比三组结果。结果72 h后, 鼠胚总体囊胚形成率为71.54％(382/534), 其中A组的囊胚形成率为30.56％(22/72), B组为70.49％(129/183), C组为82.80％(231/279), B、C组的囊胚形成率显著高于A组(P＜0.01)。结论通过鼠胚体外培养, 对新建试管婴儿实验室进行了较好的质控检测, 序贯培养液Vitrolife 系列的G1和G2以及SAGE系列的Quinn’s1026和Quinn’s1029在鼠胚囊胚形成率上要高于简单培养液EBSS。

培养液；鼠胚；囊胚；体外培养；质量控制

自1985年Ackerman等首先用2细胞鼠胚来对实验室进行质量控制(quality control, QC), 鼠胚实验(mouse embryo assay, EMA)已成为生殖医学中心胚胎培养室质量评估, 尤其是培养液质量检测最为广泛应用的方法[1]。而培养液对体外胚胎培养的重要性是不言而喻的, 一种优化的培养系统可以支持胚胎在体外或移植后形成囊胚并继而发育成胎儿[1,2]。旨在对新建IVF胚胎培养室进行质量控制, 同时对培养液进行评估, 在为将来开展人类胚胎体外培养时培养液的选择使用上积累实验数据, 本院生殖中心2014年9～12月使用3种不同培养液对昆明系小白鼠进行胚胎体外培养, 并对比分析了3个不同组别之间的4细胞胚胎、8细胞胚胎、融合胚以及囊胚形成率。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物7周龄雌性昆明系小白鼠(体质量30～35 g),10周龄雄性小鼠(体质量35～40 g), 均购自浙江中医药大学实验动物中心, 雌雄分笼饲养。

1.1.2 药物与试剂 尿促性素(HCG)与绒促性素(HMG)均购自丽珠制药厂。简单培养液EBSS购自SIGMA公司, 序贯培养液G1和G2以及配子处理液G-GAMETE购自Vitrolife公司, 序贯培养液Quinn’s1026和Quinn’s1029, 人血清白蛋白(HSA)以及石蜡油均购自SAGE公司。培养液均添加10％HAS, 表面覆油后置于37℃,6.0％培养箱中平衡过夜。

1.1.3 耗材与设备35 mm培养皿及巴斯德管均购自美国FALCON公司, CO2气体纯度为99.999％, 丹麦IVFTECH工作站, 日本OLYMPUS解剖显微镜, 美国THEMRO培养箱, 德国LABTECH CO2浓度检测仪, 美国SIGMA培养箱专用温度计。

1.2 实验方法

1.2.1 鼠胚获取与培养 雌鼠腹腔注射10 IU的HMG,48 h后再注射HCG, 注射后立即将雌雄按1∶1的比例合笼,48 h后取胚。将孕鼠颈椎脱臼处死后用眼科剪取输卵管放于覆油的G-GAMETE配子处理液中, 用1 ml注射器针头将输卵管切割数次, 挤出胚胎, 再用拉细的巴斯德管将2细胞鼠胚收集并随机分装到覆油的3种不同培养液中, 并置于培养箱中培养[3,4]。当胚胎培养到8细胞阶段, A组将胚胎转移到新配制并于前1 d过夜平衡后的EBSS培养液, B、C组则分别将胚胎从G1和Quinn’s1026培养液中转移到经过夜平衡后的G2和Quinn’s1029培养液中继续培养。

1.2.2 鼠胚的观察 观察并记录24 h后4细胞胚胎形成率,48 h后8细胞或融合胚形成率,72 h后囊胚形成率。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

在2014年9～12月本院新建IVF胚胎实验室共进行7个周期的鼠胚体外培养实验, 累计获取2细胞胚胎534枚,其中形成囊胚382枚, 总体囊胚形成率为71.54％。鼠胚培养分成3个组别进行, A组使用EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)简单培养液, 在所获得的72枚2细胞胚胎中共有22枚最终发育成囊胚, 囊胚形成率为30.56％；B组使用G1和G2序贯培养液,183枚2细胞胚胎中,129枚发育成囊胚,形成率为70.49％；C组使用Quinn’s1026和Quinn’s1029序贯培养液, 所得279枚胚胎中有231枚发育到囊胚阶段, 其形成率为82.80％。B组和C组的囊胚形成率显著高于A组(P＜0.01), 三组的胚胎发育情况及囊胚形成率, 见表1。鼠胚于覆油35 mm皿中体外培养不同时期的生长情况, 见图1。

表1 不同培养液对鼠胚发育在各个分裂阶段的影响(n, ％)

图12 -细胞鼠胚于35 mm培养皿覆油培养的发育图

3 讨论

实验室质控对试管婴儿结局有重要影响。体外一系列因素如温度、湿度、尘埃、挥发性有机物(VOC)、震动、噪音、光照、CO2浓度、pH、渗透压等都会对不具备任何屏障和保护功能的胚胎产生影响[1]。因此, 建立稳定可靠的试管婴儿实验室, 为胚胎发育提供相对稳定的场所, 维持试管婴儿成功率显得尤为重要。而在诸多影响胚胎发育的因素中, 培养液是直接和胚胎接触的介质, 同时也是实验室最常用及最重要的消耗品, 其稳定性直接决定着胚胎培养的结局。小鼠胚胎生物检测(MEA)是目前广泛用于新建或新启动周期的试管婴儿实验室的质控方法, 尤其在评估培养液的质量上发挥重要作用。

为了检测新建试管婴儿胚胎培养室是否达到人类胚胎培养标准, 同时为今后开展试管婴儿胚胎体外培养在培养液的选择使用上积累实验数据, 本院生殖中心2014年9～12月,分别用EBSS, G1/G2, Quinn’s1026/1029对小鼠胚胎进行了体外培养, 并进行了对比分析。鼠胚发育的结果显示, 在囊胚形成率上, 使用序贯培养液G1/G2, Quinn’s1026/1029进行培养的鼠胚的囊胚形成率(70.49％,82.80％)要显著高于使用简单培养液EBSS的囊胚形成率(30.56％)。而在胚胎发育过程中,作者发现使用简单培养液EBSS进行培养的胚胎在发育到4-5细胞阶段发生了较为严重的阻滞,24 h后4-5细胞的形成率为51.39％(37/72), 而发育到囊胚阶段仅有30.56％(22/72), 而使用序贯培养液的胚胎则未发生此种现象。这可能是因为序贯培养液应对胚胎在卵裂早期和晚期对能量物质和氨基酸在需求上的不同做了成分上的调整, 从而使得胚胎在代谢活动相对较弱的早期和代谢活动相当活跃的囊胚阶段都得到了合适的物质及能量支持, 如在卵裂阶段, G1/G2, Quinn’s1026/1029均不含必须氨基酸, 但到了囊胚阶段必须氨基酸的含量则远高于非必须氨基酸的含量, 而简单培养液的一个很大的不足是其不含氨基酸等复合成分, 使得其不能对胚胎发育阶段的改变做出调整, 致使胚胎发育停滞在4-5细胞阶段。而在两种序贯培养液之间的比对上, 作者发现同样添加10％人血清白蛋白HSA后, 在囊胚的形成率上使用SAGE系列的Quinn’s1026/1029(82.80％)要高于使用Vitrolife系列的G1/ G2(70.49％), 而美国梅奥医学中心的Morbeck等[5,6]最近在Fertility and Sterility的研究报告显示添加HSA的SAGE系列序贯培养液的鼠胚囊胚形成率(75％)反而略低于添加HSA的Vitrolife系列序贯培养液的培养结果(78％)。G1/G2和Quinn’s1026/1029在葡萄糖、有机酸、乳酸、丙酮酸、氨基酸、金属离子和无机盐等成分的比例上都存在一定的差异,会对胚胎培养产生不同的影响。与此同时, 不同的小鼠种系,促排卵药物的种类与剂量以及培养环境、培养油、培养用器皿、培养箱、培养方法和操作过程都有可能对胚胎的发育结局产生影响。而培养液在小鼠胚胎体外培养的效果也不完全等同于其他种系胚胎培养的效果。但通过本次实验, 更加确定了序贯培养液G1/G2和Quinn’s1026/1029在鼠胚体外培养效果上要优于早期简单培养液EBSS, 实验同样丰富了对两种序贯培养液G1/G2和Quinn’s1026/1029的认识。

[1]黄国宁, 孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术. 北京: 人民卫生出版社,2012:15 -37.

[2]黄国宁, 刘东云, 韩伟.辅助生殖技术实验室的建设及其质量控制.中国实用妇科与产科杂志,2010,26(10):755-758.

[3]王利红, 连方.两种2-细胞鼠胚体外培养方法比较.中国比较医学杂志,2009,19(11):67-69.

[4]孙新明, 魏泓, 赵永聚, 等. 昆明小鼠成熟卵母细胞体外授精及受精卵体外培养的研究. 中国比较医学杂志,2005,15(3):129-132.

[5]Morbeck DE. Importance of supply integrity for in vitro fertilization and embryo culture. Semin Reprod Med,2012,30(3):182-190.

[6]Morbeck DE, Krisher RL, Herrick JR, et al. Composition of commercial media used for human embryo culture. Fertil Steril,2014,102(3):759-766.

Influence of different culture solutions on ectogenesis of mouse embryo in newly constructed in vitro fertilization laboratory

RAO Jin-peng, LIU Qing, QIAN Xiao-hong, et al. Reproductive Medicine Center, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou310052, China

ObjectiveTo implement three different culture solutions, as EBSS (SIGMA series), G1 and G2 (Vitrolife series), Quinn’s1026 and Quinn’s1029 (SAGE series), for In vitro culture of Kunming species mouse, in order to evaluate newly constructed IVF laboratory.MethodsFemale mice aged7 weeks were selected to receive human menopausal gonadotropin (HMG)10 IU for ovulation. Human chorionic gonadotropin (HCG)10 IU was injected after48 h for follicle maturity in1:1 cage mate with male mice. After another48 h, normal mouse embryos with2 cells were taken. They were divided into3 groups. Group A received Earle’s balanced saltsolution (EBSS), group B received G1 and G2 solution, and group C received Quinn’s1026 and Quinn’s1029 solution. All solutions contained10％ human serum albumin. Comparison and analysis were made on the results of the three groups.ResultsAfter72 h, the general blastulation rate of mouse embryo was71.54％ (382/534). The blastulation rate of group A was30.56％ (22/72), that of group B was70.49％ (129/183), and that of group C was82.80％ (231/279). Group B and group C had much higher blastulation rate than group A (P＜0.01).ConclusionThe in vitro culture of mouse embryo provides good quality control for the newly constructed IVF laboratory. G1 and G2 in sequential culture Vitrolife and Quinn’s1026 and Quinn’s1029 in SAGE have higher blastulation rate than single EBSS solution.

Culture solution; Mouse embryo; Blastosphere; In vitro culture; Quality control

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.197

2015-01-04]

国家自然科学基金资助课题(项目编号：81370760)

310052 浙江大学医学院附属第二医院生殖医学中心(饶金鹏 刘青 钱小红 魏凯 陈剑 金敏)；浙江大学医学院附属妇产科医院(金帆)