梗死心肌侧枝血管形成与缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子A表达水平的关系及临床意义

戴宇翔　王审　李晨光　黄浙勇　陆浩　常书福　钱菊英　葛雷　王齐兵

颜彦1　樊冰1　张峰1　姚康1　马剑英1　黄东1　葛均波1

(1.复旦大学附属中山医院心内科，上海　200032；2. 浙江省温岭市第一人民医院心内科，浙江温岭　317500)



·论著·

梗死心肌侧枝血管形成与缺氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子A表达水平的关系及临床意义

戴宇翔1王审2李晨光1黄浙勇1陆浩1常书福1钱菊英1葛雷1王齐兵1

颜彦1樊冰1张峰1姚康1马剑英1黄东1葛均波1

(1.复旦大学附属中山医院心内科，上海200032；2. 浙江省温岭市第一人民医院心内科，浙江温岭317500)

摘要目的：探讨冠状动脉慢性完全闭塞(chronic total occlusion，CTO)后梗死心肌中侧枝血管形成与缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α)及血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)表达水平的关系及其临床意义。方法： 连续收集经冠状动脉造影明确为完全闭塞病变者214例，结合患者的临床表现及(或)影像学资料，确诊为CTO者89例。采用ELISA法检测HIF-1α和VEGF-A的蛋白水平；提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用定量PCR法测定PBMC中VEGF-A 的mRNA水平。采用JMP 9.0和SPSS 18.0统计软件进行统计学处理。结果：比较各组糖尿病患者比例，Rentrop 2级组(11/31，35.5%)和3级组(3/20，15.0%)显著低于0~1级组(18/38，47.4%)，P<0.05；比较各组的空腹血糖水平，Rentrop 2级组(6.67±1.41) mmol/L)和3级组(5.48±1.26)mmol/L)显著低于0~1级组(7.24±1.39)mmol/L)，P<0.05；比较各组患者中临床心衰(NYHA Ⅱ~Ⅳ级)的比例，Rentrop 2级组(12/31，38.7%)和3级组(3/20，15.0%)显著低于0~1级组(20/38，52.6%)，P<0.05；比较各组HIF-1α和VEGF-A的蛋白水平，Rentrop 2级组[(85.5±27.7) pg/mL，(139.5±42.1) pg/mL]和3级组[(103.3±30.2) pg/mL，(162.6±43.3) pg/mL]显著高于0~1级组[(42.0±16.1)pg/mL，(76.5±32.2) pg/mL]，P均<0.01；比较各组HIF-1α和VEGF-A的mRNA水平,Rentrop 2级组(1.31±0.46)和3级组(1.38±0.44)VEGF-A的 mRNA相对表达水平显著高于0~1级组(1.00±0.28)，P<0.01。结论：慢性持续缺血、缺氧所导致的HIF-1α和VEGF表达增加在促进冠状动脉侧枝循环的建立、增加心肌血供、改善预后、减少临床心功能不全的发生率方面具有重要意义。

关键词冠状动脉慢性完全闭塞；冠状动脉侧枝循环；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子A

近十几年来，冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的治疗取得了长足发展，经皮冠状动脉内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)、冠状动脉内支架置入术、冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)等已成为临床上成熟的治疗手段。然而，很多急性心肌梗死患者以及存在复杂病变(包括弥漫性小血管病变、慢性完全性堵塞病变、冠心病多支血管病变、多次介入治疗或手术后血管闭塞等)的冠心病患者经治疗后仍不能实现完全的血运重建。对这类患者而言，建立有效供血的侧枝循环十分重要，有助于恢复缺血心肌的血供、挽救濒死心肌、改善患者的症状和预后。新生血管生成则是建立有效侧枝循环的第一步[1-3]。

血管的生成十分复杂，涉及多种基因的表达在空间和时间上的严密调控[4]。目前，关于缺血心肌的侧枝循环形成过程中新生血管形成的机制尚不明了。在已发现的促血管生成因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的血管生成调节因子，它可能在多种血管生成因子中起中心调控作用[5-6]。研究[7-8]表明，血管中VEGF基因的表达受缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)调控。本研究探讨冠状动脉慢性完全闭塞(chronic total occlusion，CTO)患者中冠状动脉侧枝血管的形成与VEGF及HIF-1α表达水平的关系及临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料连续收集2014年9月—2014年12月在复旦大学附属中山医院经冠状动脉造影明确为完全闭塞病变的患者214例。结合患者临床表现及(或)相应影像学资料，214例中89例确诊为CTO。入选标准：既往有心绞痛症状或核素扫描、运动试验、动态心电图等证实存在心肌缺血的客观证据，选择性冠状动脉造影显示冠状动脉血管100%闭塞，远端血流心肌梗死溶栓试验(thrombolysis in myocardial infarction，TIMI)0级，闭塞血管直径≥2.5 mm，闭塞时间≥3个月。本研究中的患者或家属均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1收集、记录临床资料收集并记录患者的一般资料、冠心病危险因素(高血压病史、高胆固醇病史、糖尿病病史、目前吸烟状态等)和心功能指标[左室射血分数、纽约心脏协会(New York Heart Association,NYHA)分级情况等、氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)]；在患者入院后立即测量糖代谢指标(空腹血糖等)、脂代谢指标(总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等)并记录结果。

1.2.2冠状动脉造影(coronary arteriography，CAG)应用德国Siemens公司 Axiom-Artis DTA平板数字减影血管造影系统和美国GE公司 Innova 2000全数字血管造影系统，从股动脉或桡动脉采用Judkins法行选择性冠状动脉造影，采用GE centricity AI 1000-GE Mnet软件 (Version 4.2.7.05)分析CAG图像。

1.2.3侧枝循环的判定由两位专科医师阅读冠状动脉造影资料。观察侧枝循环的来源、走行及闭塞血管远端的充盈情况。采用Rentrop法对侧枝循环进行评分：0 级侧枝血管即病变远端无造影剂显影；Ⅰ级为病变远端仅有轻微的造影剂显影或小段的血管；Ⅱ级为病变远端可见长段血管显影，但显影较正常血管浅淡和缓慢；Ⅲ级为病变远端全部血管均显影，且造影剂浓度与正常血管一致。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血HIF-1α和VEGF-A水平取2 mL全血至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，4℃以1500 r/min的速度离心 10 min，收集血细胞；裂解血细胞，提取总蛋白并定量；应用美国Thermo Scientific公司的Human HIF-1αELISA Kit检测HIF-1α蛋白水平，按照试剂盒的说明操作。取2 mL全血至EDTA抗凝管中，静置 1 h，于4℃以1500 r/min的速度离心10 min，取上清； 应用美国Invitrogen公司的Human VEGF-A ELISA Kit 检测血清中的VEGF-A，按说明书操作。

1.2.5定量PCR检测外周血单个核细胞(PBMC)中VEGF-A mRNA水平取10mL全血至EDTA抗凝管中，采用Ficoll分层液密度梯度离心法提取PBMC后，用Trizol(美国Invitrogen公司)抽取总RNA。取1 μg总RNA，用Prime Script反转录酶[宝生物工程(大连)有限公司]和随机引物将mRNA反转录成cDNA。定量PCR扩增仪选用罗氏诊断产品(上海)有限公司的Light Cycler，试剂为SYBR Premix Ex Taq [宝生物工程(大连)有限公司]。PCR程序为：95℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，重复40个循环。通过2ΔΔCt法对VEGF-A的mRNA表达量进行相对定量，内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。VEGF-A和GAPDH的引物见表1。

表1　PCR引物序列

2结果

2.1各组患者的临床资料比较CTO病变侧枝循环评分中Rentrop 0～1级组、2级组和3级组患者的临床资料见表2。其中，Rentrop 2级组(11/31，35.5%)和3级组(3/20，15.0%)中糖尿病患者比例显著低于0～1级组(18/38，47.4%)，差异均有统计学意义(P<0.05)；Rentrop 2级组[(6.67±1.41)mmol/L]和3级组[(5.48±1.26)mmol/L]的空腹血糖水平显著低于0～1级组[(7.24±1.39)mmol/L]，差异有统计学意义(P值均<0.05)；Rentrop 2级组(12/31，38.7%)和3级组(3/20，15.0%)的临床心衰(NYHAⅡ～Ⅳ级)比例显著低于0～1级组(20/38，52.6%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2　各组患者的一般资料比较　(n, %)

注：LVEF：左室射血分数；NYHA：纽约心功能分级；T-CHO：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；hs-CRP：超敏C反应蛋白；NT-proBNP：氨基末端脑钠肽前体

2.2各组患者血液中的HIF-1α和VEGF-A水平比较ELISA法检测CTO病变侧枝循环评分中Rentrop 0～1级组、2级组和3级组患者的血液HIF-1α和VEGF-A水平。结果显示，Rentrop 2级组[(85.5±27.7)pg/mL和(139.5±42.1)pg/mL]、3级组[(103.3±30.2)pg/mL和(162.6±43.3)pg/mL]的HIF-1α和VEGF-A水平均明显高于0～1级组[(42.0±16.1)pg/mL和(76.5±32.2)pg/mL]，差异均有统计学意义(P<0.001)，见图1。

图1　ELISA法检测不同侧枝循环组患者的HIF-1α(A)和VEGF-A(B)水平

2.3各组患者PBMC中的VEGF-A mRNA表达水平比较定量PCR法检测CTO病变侧枝循环评分中Rentrop 0～1级组、2级组和3级组患者PBMC中的VEGF-A mRNA表达水平。结果显示，Rentrop 2级组(1.31±0.46)和3级组(1.38±0.44)的VEGF-A mRNA相对表达水平均明显高于0～1级组(1.00±0.28)，差异均有统计学意义(P<0.001)。见图2。

图2　定量PCR法检测PBMC中VEGF-A mRNA的相对表达水平

3讨论

冠状动脉完全闭塞导致心肌组织发生缺血、缺氧时，组织细胞分泌多种细胞因子，这些因子参与损伤后的炎性反应和组织修复[1-2,8-9]。VEGF是近年来已得到公认的重要的促血管生长因子，其直接作用于血管内皮细胞特异性有丝分裂原，是心肌正常生理状态以及病理状态下新生血管生成的重要调节因子。HIF-1α是一种由缺氧诱导产生的DNA结合蛋白。缺氧情况下诱导HIF-1α表达增加是机体的一种适应性反应[8,10-11]。VEGF是HIF-1α的下游靶基因，HIF-1α是VEGF转录的活化因子[7-8, 11-12]。

既往研究发现，心肌缺血、缺氧时VEGF水平升高，刺激冠状动脉内皮细胞激活、分裂和增殖，在心脏尤其是缺血心肌处冠状动脉的原有侧枝循环增加并有新生毛细血管形成[5-6]；而当细胞处于低氧环境时，VEGF表达水平随着HIF-1α表达量的增加而升高[7-8,11-12]。本研究也发现，在冠状动脉慢性完全闭塞所导致的心肌局部持续缺血、缺氧情况下，侧枝循环形成良好组(Rentrop 2级和3级)的HIF-1α和VEGF-A水平均显著高于无良好侧枝循环组(Rentrop 0～1级)。HIF-1α和VEGF表达的一致性提示，CTO患者心肌缺血、缺氧时VEGF水平的升高可能是通过缺氧时HIF-1α的表达增加介导的。既往研究表明，HIF-1α在调节VEGF的信号转导过程中起着中枢纽带作用，它不仅提高了VEGF的转录活性，而且可增强VEGF mRNA的稳定性[7, 11]，这可能是本研究中侧枝循环形成良好组中VEGF mRNA水平升高的另一个原因。

本研究还发现，在临床表现上，侧枝循环形成良好组(Rentrop 2级和3级)中糖尿病患者比例及空腹血糖水平都显著低于无良好侧枝循环组(Rentrop 0～1级)，提示糖尿病不利于冠状动脉侧枝循环的形成。这一研究结果与既往相关文献报道相一致，可能与糖尿病导致的内皮功能障碍有关[13-14]。而侧枝循环形成良好组患者的临床心功能不全发生率显著低于无良好侧枝循环组，提示侧枝循环形成可以使机体对心肌缺血产生代偿性适应，有效抑制心肌缺血，减少心肌重塑，从而降低心衰发生风险[15-16]。

综上所述，增加VEGF表达可促进冠状动脉侧枝循环建立，使机体对心肌缺血产生代偿性适应，减少心肌缺血，增加心肌血供，减少恶性心血管事件的发生。同时，VEGF表达升高所导致的新生血管形成有利于内皮祖细胞的存活、归巢、定向分化及心肌修复。因而，HIF-1α介导的VEGF表达有可能成为治疗严重心肌缺血的一个新的方向。

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Relationship between Myocardial Collateral Vessel Formation and the Levels of Hypoxia-Inducible Factor 1-alpha and Vascular Endothelial Growth Factor A and Its Clinical Significance

DAIYuxiang1WANGShen2LIChenguang1HUANGZheyong1LUHao1CHANGShufu1QIANJuying1GELei1WANGQibing1YANYan1FANBing1ZHANGFeng1YAOKang1MAJianying1HUANGDong1GEJunbo11.DepartmentofCardiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032，China; 2:DepartmentofCardiology,TheFirstPeople’sHospitalofWenling,Wenling317500,China

AbstractObjective：The goal of this study was to analyze the clinical significance of relationship between myocardial collateral and the levels of hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) in patients with coronary chronic total occlusion lesion. Methods:89 patients with coronary chronic total occlusion lesion confirmed by clinical data and coronary angiography were identified. The levels of HIF-1α and VEGF-A were measured by ELISA, and the relative expression of VEGF-A of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) were measured by real-time PCR. The results were statistically analyzed by the statistical programme for social sciences (SPSS version 18.0) and software SAS JMP 9.0. Results: Compared to Rentrop 0-1 grade group (18/38，47.4%), Rentrop 2 (11/31，35.5%) and Rentrop 3 (3/20，15.0%) grade group had fewer diabetes mellitus. Rentrop 2 [(6.67±1.41) mmol/L] and Rentrop 3 [(5.48±1.26) mmol/L] grade group had lower fasting blood glucose than Rentrop 0-1 grade group [(7.24±1.39) mmol/L]. Rentrop 2 (12/31，38.7%) and Rentrop 3 (3/20，15.0%) grade group had fewer clinical heart failure (NYHA Ⅱ~Ⅳ grade) than Rentrop 0-1 grade group (20/38，52.6%). Rentrop 2 [(85.5±27.7) pg/mL，(139.5±42.1) pg/mL] and Rentrop 3 [(103.3±30.2) pg/mL，(162.6±43.3) pg/mL] grade group had higher levels of HIF-1α and VEGF-A than Rentrop 0-1 grade group [(42.0±16.1) pg/mL，(76.5±32.2) pg/mL]. Rentrop 2 (1.31±0.46) and Rentrop 3 (1.38±0.44) grade group had higher level of relative expression of VEGF-A in PBMC than Rentrop 0-1 grade group (1.00±0.28). Conclusions: Chronic and consistent ischemia and hypoxia induced the increase of expression of HIF-1α and VEGF-A is important for establishment of coronary collateral, increasing blood supply and improving the heart function and prognosis.

Key WordsCoronary chronic total occlusion;Coronary collateral circulation;Hypoxia-inducible factor 1-alpha;Vascular endothelial growth factor A

通讯作者葛均波，E-mail：ge.junbo@zs-hospital.sh.cn

中图分类号R 542.2

文献标识码A