注射用头孢噻肟钠无菌检验的方法学确认

朱蓓芬

（上海新亚药业有限公司，上海 201203）

0 引言

注射用头孢噻肟钠适用于敏感细菌所致的肺炎及其他下呼吸道感染、尿路感染、脑膜炎、败血症、腹腔感染、盆腔感染、皮肤软组织感染、生殖道感染、骨和关节感染等。根据《中华人民共和国药典》（2010年版）要求，需对其进行无菌检验。

新版GMP（2010年修订）第223条规定，符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：（1）采用新的检验方法；（2）检验方法需变更的；（3）采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；（4）法规规定的其他需要验证的检验方法。

同时，《中华人民共和国药典》（2010年版）要求，当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适用于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，应重新验证检查方法。

因此，当样品检验条件或检验方法等发生改变时，必须对样品进行无菌检验的方法验证试验。该验证试验主要针对该产品在该检验条件下的抑细菌、抑真菌活性及所用的无菌检查法的可靠性进行验证，以确认供试品在该检查量、检查条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。依据《中华人民共和国药典》（2010年版）附录（ⅪH）“无菌检查法”，通过验证试验对该产品的检查方法的可靠性及其结果的准确性予以确认。

1 试验所用仪器、试药、试剂、培养基与菌株

1.1 试验所用仪器

集菌仪：HTY-601型，杭州泰林生物技术设备有限公司；一次性全封闭集菌培养器：NKF330型，杭州泰林生物技术设备有限公司；生物安全柜：B-2型，上海基汇生物科技有限公司；垂直流超净工作台：ZHJH-C2112B型，上海智城分析仪器制造有限公司；电热恒温培养箱：HHB11-600型，上海跃进医疗器械厂；脉动真空蒸汽灭菌柜：YXQ-MG-206Ⅱ型/YXQ-MG-206型/YXQ-MG-208型，江苏张家港市华菱医疗设备制造有限公司；分析天平：FA1604S，上海天平仪器厂。

1.2 试验所用试药

注射用头孢噻肟钠：1.5 g，上海新亚药业有限公司。

1.3 试验所用试剂

蛋白胨（生化试剂）：上海盛思生化科技有限公司；青霉素酶：苏州金色谱生物技术有限公司；氯化钠（分析纯）：宜兴市达华化工有限公司；聚山梨酯-80（分析纯）：上海申宇医药化工有限公司。

1.4 试验所用培养基

试验所用培养基均来自北京三药科技开发公司。硫乙醇酸盐流体培养基（生化试剂）；改良马丁培养基（生化试剂）；营养琼脂培养基（生化试剂）；改良马丁琼脂培养基（生化试剂）。

1.5 试验所用菌株

试验所用菌株均来自上海东方药品科技实业有限公司。

金黄色葡萄球菌：CMCC（B）26003；大肠埃希菌：CMCC（B）44102；枯草芽孢杆菌：CMCC（B）63501；生孢梭菌：CMCC（B）64941；白色念珠菌：CMCC（F）98001；黑曲霉：CMCC（F）98003。（1）分装于25 mm×150 mm小试管中，每管装量9 m L，管口塞上硅胶塞；（2）分装于500m L盐水瓶中，每瓶装量250m L或500m L，瓶口塞硅胶塞，加铝盖，用自动轧盖机轧盖，2～25℃保存。

2.1.1.3 含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%无菌氯化钠溶液（吐温盐水）

称取氯化钠9 g，加0.5m L聚山梨酯-80，加纯化水1 000m L，加热搅拌溶解。分装于25mm×150mm小试管中，每管装量9m L，管口塞上硅胶塞，2～25℃保存。

2.1.2 稀释剂（试液）、冲洗剂（试液）的灭菌与使用范围

稀释剂（试液）、冲洗剂（试液）的灭菌与使用范围如表1所示。

表1 稀释剂（试液）、冲洗剂（试液）的灭菌与使用范围

2 确认方法

2.1 稀释剂（试液）、冲洗剂（试液）确认

2.1.1 稀释剂（试液）、冲洗剂（试液）的配制

2.1.1.1 0.1%蛋白胨水溶液

称取蛋白胨1.0 g，置1 000 m L搪瓷杯中，加纯化水至1 000m L，微温溶解，过滤。用6mol/L氢氧化钠溶液调节pH，pH为6.9～7.2。分装至500m L盐水瓶中，分装量500m L/瓶，瓶口塞硅胶塞，加铝盖，用自动轧盖机轧盖，2～25℃避光保存。

2.1.1.2 0.9%无菌氯化钠溶液

称取氯化钠9 g，加纯化水1 000m L，搅拌溶解。

2.2 培养基确认

2.2.1 培养基的配制

2.2.1.1 硫乙醇酸盐流体培养基

称取硫乙醇酸盐培养基干粉29 g，加入纯化水1 000m L，加热搅拌至沸，使其溶解均匀。用2mol/L盐酸或6 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，使灭菌后pH为6.9～7.3。100m L盐水瓶分装量100m L/瓶，250 m L盐水瓶分装量200 m L/瓶，瓶口塞硅胶塞，加铝盖，用自动轧盖机轧盖，2～25℃避光保存。

2.2.1.2 改良马丁培养基

称取改良马丁培养基干粉28.5 g，加入纯化水1 000m L，加热搅拌至沸，使溶解均匀。用2mol/L盐酸或6mol/L氢氧化钠溶液调节pH，使灭菌后pH为6.2～6.6。100m L盐水瓶分装量100m L/瓶，瓶口塞硅胶塞，加铝盖，用自动轧盖机轧盖，2～25℃避光保存。

2.2.1.3 营养琼脂培养基

称取营养琼脂干粉32 g，加入纯化水1 000m L，加热搅拌至沸，使其溶解均匀。用2 mol/L盐酸或6mol/L氢氧化钠溶液调节pH值，使灭菌后pH值为7.0～7.4。

灭菌双碟分装量20m L/只，冷却凝固后，翻转移至30～35℃恒温培养箱中培养48 h，检查无菌即可使用，2～25℃避光保存。

2.2.1.4 改良马丁琼脂培养基

称取改良马丁琼脂干粉42g，加入纯化水1000m L，加热搅拌使其至沸，使其溶解均匀。用2 mol/L盐酸或6 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值，使灭菌后pH值为6.2～6.6。

灭菌双碟分装量20m L/只，冷却凝固后，翻转移至23～28℃恒温培养箱中培养72 h，检查无菌即可使用，2～25℃避光保存。

2.2.2 培养基的灭菌与使用范围

培养基的灭菌与使用范围如表2所示。成1m L含10～100 cfu的菌悬液，2～8℃保存。

2.3.1.2 大肠埃希菌

接种大肠埃希菌的新鲜培养物1环至9m L 0.9%氯化钠溶液中，用0.9%氯化钠溶液制成1 m L含10～100 cfu的菌悬液，2～8℃保存。

2.3.1.3 枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌的新鲜培养物用9m L 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱，用0.9%氯化钠溶液制成1m L含10～100 cfu的菌悬液，2～8℃保存。

2.3.1.4 生孢梭菌

生孢梭菌的新鲜培养物用0.9%氯化钠溶液制成1m L含10～100 cfu的菌悬液，2～8℃保存。

2.3.1.5 白色念珠菌

白色念珠菌的新鲜培养物用9m L 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱，用0.9%氯化钠溶液制成1 m L含10～100 cfu的菌悬液，2～8℃保存。

2.3.1.6 黑曲霉

黑曲霉用含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱，制成黑曲霉孢子液，用9m L含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%无菌氯化钠溶液制成1m L含10～100 cfu的菌悬液，2～8℃保存。

2.3.2 活菌计数

表2 培养基的灭菌与使用范围

2.3 菌液制备的确认

2.3.1 菌液制备方法

2.3.1.1 金黄色葡萄球菌

接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物1环至9 m L 0.9%氯化钠溶液中，用0.9%氯化钠溶液制

打开薄膜过滤器盖子，加入50m L 0.1%蛋白胨水溶液，加入1m L含＜100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌液，旋紧薄膜过滤器的盖子，打开抽滤泵过滤，待液体完全抽干后，拧开薄膜，用镊子拿掉垫圈并取出薄膜。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌面朝上贴于营养琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉菌面朝上贴于改良马丁琼脂培养基，将培养皿盖盖好。将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的培养皿倒置于30～35℃培养箱中培养24 h，将白色念珠菌、黑曲霉的培养皿倒置于23～28℃培养箱中培养48 h，计数。

2.4 冲洗量的确定（加酶试验）

取注射用头孢噻肟钠30瓶，取全量，溶解于500m L 0.9%氯化钠溶液中作为供试液（供试品含量为0.09 g/m L）。取供试液50m L（相当于供试品4.5 g，符合药典规定的检验量0.15 g/瓶×30瓶）至3张薄膜，过滤后，用1 500m L、2 000m L两个冲洗量的0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜（单张薄膜冲洗量为500 m L、667m L），将冲洗液抽干，用针筒抽取青霉素酶6m L至300m L硫乙醇酸盐流体培养基中，用双芯针头取300m L硫乙醇酸盐流体培养基后，将软管剪断，用针筒抽取1m L含10～100 cfu试验菌加入全封闭集菌培养器中，软管套于空气滤器开口上，放入30～35℃培养箱培养，每天观察培养结果。观察培养结果详细记录从略。

2.5 无菌试验（加酶）

2.5.1 酶验证试验组

取注射用头孢噻肟钠30瓶，取全量，溶解于500 m L 0.9%氯化钠溶液中作为供试液（供试品含量为0.09 g/m L）。

取供试液50m L（相当于供试品4.5 g，符合药典规定的检验量0.15 g/瓶×30瓶）至3张薄膜，过滤后，单张薄膜用667m L 0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜，将冲洗液抽干，用针筒抽取青霉素酶4 m L至200 m L硫乙醇酸盐流体培养基、抽取2 m L至100 m L改良马丁培养基中，用双芯针头取200 m L硫乙醇酸盐流体培养基、100m L改良马丁培养基后，将软管剪断，用针筒抽取1m L含10～100 cfu试验菌加入全封闭集菌培养器中，软管套于空气滤器开口上，放入培养箱培养5 d，每天观察培养结果。

2.5.2 酶验证稀释剂对照组

用500m L 0.9%氯化钠和2 000m L 0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜，将冲洗液抽干，用针筒抽取青霉素酶4m L至200 m L硫乙醇酸盐流体培养基、抽取2m L至100m L改良马丁培养基中，用双芯针头取200m L硫乙醇酸盐流体培养基、100m L改良马丁培养基后，将软管剪断，用针筒抽取1 m L含10～100 cfu试验菌加入全封闭集菌培养器中，软管套于空气滤器开口上，放入培养箱培养5 d，每天观察培养结果。

2.5.3 酶验证菌液组

将10～100 cfu试验菌直接加入硫乙醇酸盐流体培养基或者改良马丁培养基中，培养5 d，观察结果。

2.5.4 培养方法

培养方法如表3所示。

表3 培养方法

2.5.5 观察记录

注射用头孢噻肟钠（1.5 g）无菌试验（加酶）原始记录从略。

3 确认结果与总结

3.1 确认结果

3.1.1 冲洗量确定试验（加酶）

冲洗量确定试验操作方法进行两次独立的平行试验。两次试验中：单张膜为667m L 0.1%蛋白胨水溶液的冲洗量，能使阳性菌生长良好；单张膜为500 m L 0.1%蛋白胨水溶液的冲洗量，阳性菌生长缓慢。因此，选用单张膜为667m L 0.1%蛋白胨水溶液的冲洗量作为各试验菌试验的冲洗量。

3.1.2 无菌试验（加酶）

无菌试验操作方法分3组进行两次独立的平行试验。其中，酶验证试验组：所有试验菌均生长良好；酶验证稀释剂对照组：所有试验菌均生长良好；酶验证菌液组：所有试验菌均生长良好。因此，检验方法成立，可按该方法对供试品进行无菌检查。

3.2总结

（1）该方法确认结果可行，确认过程符合《中华人民共和国药典》（2010版）与新版GMP要求。

（2）注射用头孢噻肟钠无菌检验方法可制订如下：取注射用头孢噻肟钠30瓶，取全量，溶解于500 m L 0.9%氯化钠溶液中作为供试液（供试品含量为0.09 g/m L）。取供试液50 m L（相当于供试品4.5 g，符合药典规定的检验量0.15 g/瓶×30瓶）至3张薄膜，过滤后，单张薄膜用667m L 0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜，将冲洗液抽干，用针筒抽取青霉素酶4 m L至200 m L硫乙醇酸盐流体培养基、抽取2 m L至100m L改良马丁培养基中，然后用夹子夹住其中一根软管，用双芯针头取200m L硫乙醇酸盐流体培养基至其中两个全封闭集菌培养器中，再用夹子夹住另两根软管，用双芯针头取100m L改良马丁培养基至另一个集菌培养器中，然后将集菌培养器上软管剪断，其中一个装有硫乙醇酸盐流体培养基和另一个装有改良马丁培养基的集菌培养器，软管套于全封闭集菌培养器的空气过滤口上，置培养房中培养14 d，观察结果。另一个装硫乙醇酸盐流体培养基的集菌培养器中注入10～100 cfu大肠埃希菌作为阳性对照。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010版）[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统[M].北京：中国医药科技出版社，2011.

[3]药品生产质量管理规范（2010年修订）[S]，2011.