内脂素在糖尿病大鼠肝组织的表达及其对肝糖代谢的作用＊

张安星，张 晗，阳 琰，高 琳，廖 鑫，杨孟雪

（遵义医学院附属医院内分泌科，贵州遵义563000）

糖尿病是全球普遍关注的严重影响人类健康的疾病，体内多种因素与糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗这些病理状态相关，但目前糖尿病发生、发展的确切机制并不完全清楚。有研究显示内脂素（visfatin）具有类胰岛素的作用，能调节血糖，在机体糖脂代谢中发挥重要作用［1］，但研究报道其在糖脂代谢及胰岛素抵抗中的作用并不一致。本研究通过建立糖尿病及肥胖大鼠动物模型，测定肝组织中visfatin、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的表达，探讨visfatin与葡萄糖6磷酸酶（G-6-Pase）、AMPK 的关系，将可能为糖尿病及胰岛素抵抗的防治提供理论依据。

表1 PCR 引物序列及产物长度

表2 各组大鼠代谢指标比较（±s）

表2 各组大鼠代谢指标比较（±s）

-：此项无数据。

组别 n 体质量（g） 内脂质量／体质量（%）FBG（mmol／L）FFA（mmol／L）TG（mmol／L）TC（mmol／L）HOMA-IR ISI NC组 10 408.60±44.11 2.17±0.54 4.40±1.05 375.50±163.75 0.24±0.09 1.11±0.32 2.01±0.74 0.030 0±0.010 0 DIO组 12 619.00±29.55 4.29±1.05 5.11±0.57 479.42±151.71 1.13±0.48 1.59±0.41 5.61±2.23 0.010 0±0.005 0 DM 组 10 405.80±69.53 2.03±0.81 25.52±2.75 1 260.30±587.67 6.65±3.07 6.71±3.27 43.21±10.72 0.001 0±0.000 2 INS组 9 468.45±33.31 3.61±1.02 6.04±1.57 727.44±280.41 2.72±1.34 1.89±0.32 - -MET组 9 422.67±29.27 2.62±1.25 6.97±1.35 646.56±1 92.97 1.55±0.61 1.80±0.33 - -

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD 大鼠70只，体质量180～220g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心提供。高脂高糖饲料为在普通饲料中加20%的炼猪油、10%的蛋黄、5%的葡萄糖、2%的胆固醇。胰岛素放免试剂盒（科美东雅公司），链脲佐菌素（STZ，sigma），Trizol Reagent、逆转录试剂盒、焦碳酸二乙酯（DEPC）、SYBR®GREEN PCR Master Mix；辣根过氧化物酶标记兔抗山羊、小鼠IgG、RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白浓度定量试剂盒、彩色预染marker、ECL 显色试剂盒由碧云天生物有限公司提供；引物由宝生物公司合成，visfatin抗体由Biovision公司提供；AMPKα抗体、p-AMPKα抗体均由cell signaling 公司提供；β-actin抗体由中杉金桥公司提供；盐酸二甲双胍（施贵宝公司），胰岛素注射液（万邦公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 适应性喂养SD大鼠1周后，分为正常对照组（NC组）10只、肥胖组（DIO 组）15只、糖尿病组（DM 组）15只、胰岛素治疗（INS组）15只、二甲双胍治疗组（MET 组）15只。NC组大鼠普通饲料喂养，其余大鼠用高脂高糖饲料喂养。DIO 组喂养12周，禁食12h后称体质量，大于NC组大鼠平均体质量20%者为DIO 成模，共成模12 只。DM 组、INS组、MET 组大鼠经喂养8周后禁食12h后称质量，按40mg／kg腹腔注射链脲佐菌素，1 周后测FPG，2 次FPG≥16.7 mmol／L为糖尿病大鼠成模，共成模10只。NC组、DIO组 腹腔注射0.1 mmol／L 柠檬酸缓冲液。INS组用低精蛋白锌胰岛素腹部皮下注射，使FPG＜11.1mmol／L，共有成模9只；二甲双胍300mg·kg-1·d-1灌胃，控制FPG＜11.1 mmol／L，共计成模9只。至12周全部大鼠禁食12h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后腹主动脉取血，血清测FFA、TG、TC、Fins。肝脏放入-80 ℃冰箱保存；另取同一部位小块肝脏液氮速冻后移入-80 ℃冰箱冻存。

1.2.2 血清生化指标检测 强生稳步倍加型血糖仪及相应配套试纸测定FBG，FFA、TG、TC 用全自动生化分析仪检测，放射免疫法检测血清Fins。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）＝FBG×Fins／22.5。胰岛素敏感性指数（ISI）＝1／（Fins×FBG）。

1.2.3 RT-PCR检测肝组织中visfatin、G-6-Pase mRNA 的表达 用美国BIO-RAD公司icycler荧光定量PCR 仪，按TaKa-Ra逆转录试剂盒说明将RNA 逆转录为cDNA。采用15μL PCR反应体系：iQ SYBR Green Supermix 7.5μL，模板混合液0.5μL，cDNA template 3μL，DEPC水4μL。反应条件：95℃3min；95 ℃10s，退火温度61.6 ℃30s，循环40次。取CT平均值。引物序列见表1。

1.2.4 Western blot测定visfatin、AMPKα、p-AMPKα的蛋白表达 肝脏组织PBS洗涤剪碎后加入RIPA 裂解液，震碎、裂解，离心后取上清液。BCA 法测定蛋白浓度。100 ℃、5 min蛋白变性后上样电泳，转膜，封闭，加入visfatin／AMPKα／p-AMPKα一抗孵育过夜，次日加入二抗，孵育1h显影，凝胶成像拍照并条带扫描。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0对数据进行统计学分析，计量资料用±s表示，多组间采用方差分析，偏态分布经秩次转换。正态分布数据用Perason相关分析，非正态分布数据用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠代谢指标比较 DIO 组、INS组内脂质量／体质量较NC 组明显升高，DM 组、MET 组内脂质量／体质量较DIO 组显著降低（P＜0.01），INS组内脂质量／体质量较DM组显著升高（P＜0.01），MET 组内脂质量／体质量较INS组显著下降（P＜0.05）。DM 组FBG 比NC 组、DIO 组显著升高（P＜0.01）；INS 组、MET 组FBG 比DM 组 明 显 降 低（P＜0.01）。DIO 组、DM 组HOMA-IR均较NC组明显升高，而ISI均显著降低（P＜0.01）；DM 组HOMA-IR 较DIO 组明显升高，ISI明显降低（P＜0.01）。DIO 组TG 较NC 组显著升高（P＜0.01）；DM 组、INS组及MET 组TG、TC 均比NC 组 明显升高（P＜0.05）；DM 组TG 比DIO 组明显升高（P＜0.05）；MET 组、INS组TG 比DM 组明显降低（P＜0.05）。DM 组、INS组、MET 组FFA 较NC 组显著升高（P＜0.05）；DM 组FFA 较DIO 组显著增高（P＜0.05），见表2。

2.2 各组大鼠肝组织visfatin、G-6-Pase mRNA 比较 DM 组visfatin mRNA 较NC组、DIO 组均显著升高（P＜0.05），INS组、MET 组visfatin mRNA 均较DM 组显著下降（P＜0.01）。DM 组、INS组、MET 组G-6-Pase mRNA 均 较DIO 组 显 著 升高（P＜0.05），DIO 组G-6-Pase mRNA 均 较NC 组 显 著 降 低（P＜0.01），MET 组G-6-Pase mRNA 较DM 组及INS组均显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肝组织visfatin、G-6-Pase mRNA 表达比较（±s）

表3 各组大鼠肝组织visfatin、G-6-Pase mRNA 表达比较（±s）

组别 n visfatin G-6-Pase NC组5 65.41±28.73 131.57±31.46 DIO 组 5 116.23±57.66 35.12±7.65 DM 组 5 220.03±96.62 159.37±39.92 INS组 5 40.32±10.52 194.50±59.87 MET 组5 36.05±16.51 108.40±26.23

2.3 各组大鼠肝组织visfatin、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达比 较 DM 组、INS 组、MET 组visfatin蛋 白 表 达 均 较NC 组明显升高（P＜0.05）；DM 组、INS组、MET 组AMPKα蛋白表达均较NC组显著降低（P＜0.05），DM 组AMPKα的蛋白表达较DIO 组显 著 降 低（P＜0.05）。DIO 组、DM 组、INS 组、MET 组p-AMPKα蛋白的表达较NC组显著降低（P＜0.01），见表4、图1。

表4 各组大鼠肝组织visfatin、AMPKα、 p-AMPKα蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠肝组织visfatin、AMPKα、 p-AMPKα蛋白表达比较（±s）

组别 n visfatin AMPKα p-AMPKα NC组5 0.38±0.18 1.19±0.22 0.83±0.08 DIO 组 5 0.60±0.22 0.94±0.14 0.43±0.03 DM 组 5 0.75±0.23 0.66±0.23 0.37±0.03 INS组 5 0.69±0.08 0.89±0.20 0.39±0.04 MET 组5 0.66±0.14 0.77±0.25 0.48±0.13

图1 各组大鼠肝组织visfatin、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达

2.4 visfatin 表达与G-6-Pase表达相关性分析 NC 组visfatin mRNA 与G-6-Pase mRNA 表达呈正相关（r＝1.000，P＜0.01），INS 组visfatin 与G-6-Pase mRNA 表 达 呈 负 相 关（r＝-0.996，P＝0.004）

3 讨 论

visfatin高表达于人及动物的脂肪细胞、肝细胞、骨骼肌、肾脏及心脏等部位，研究认为其能够调节胰岛素分泌［1］，目前国内外关于visfatin在肝脏中的表达研究结果并不一致。研究表明KKAy小鼠随着糖尿病的发展，肝脏visfatin mRNA 的表达有逐渐增高趋势［1］；高脂喂养大鼠visfatin mRNA 的表达随时间的延长逐渐增高［2］，也有研究认为2型糖尿病患者肝脏visfatin mRNA 表达较糖耐量正常者降低［3］。在糖尿病小鼠模型中显示短期激活肝脏AMPK 可使血糖降低［4］。研究发现，激活AMPK 可以降低肝糖代谢中两种关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和G-6-Pase的表达［5］。目前已经发现AMPK的活性可受多种脂肪因子调节，而visfatin对AMPK 的调节作用尚不清楚，体外培养的大鼠脂肪细胞中，二十碳五烯酸能够通过激活AMPK 通道而增加visfatin的表达与分泌［6］。研究发现visfatin可能下调AMPK 活性［2］，肥胖大鼠内脏脂肪visfatin蛋白表达和AMPK 的活化负相关。

本研究建立起具有胰岛素抵抗与胰岛素分泌障碍的糖尿病大鼠模型，INS组内脂质量较DM 组明显增加，而MET 组则明显低于INS组。DM 组、INS组、MET 组visfatin蛋白表达较NC组显著升高，DM组visfatin mRNA表达量较NC组及DIO 组显著升高，可能是血糖的升高导致组织代偿性的分泌更多的visfatin，胰岛素代谢通路被激活，而血糖降低对visfatin的表达起了负反馈调节作用，INS组、MET组visfatin mRNA 的表达均较DM 组显著下降，与Chen等［4］的研究实验结果一致。AMPK 通道的激活被认为是二甲双胍发挥降糖作用的重要途径，MET 组visfatin、AMPKα、p-AMPKα蛋白的表达与INS 组无显著差异，visfatin 蛋白的表达与AMPKα、p-AMPKα蛋白的表达并无明显相关性，提示二甲双胍激活AMPK 降血糖的机制中并无visfatin的直接参与。

本实验中DM 组G-6-Pase mRNA 表达较DIO 组明显升高，这与国 内报 道 一 致［7］，而MET 组G-6-Pase mRNA 较DM组、INS组均显明降低，NC 组中visfatin mRNA 与G-6-Pase mRNA 的表达呈正相关，其因果关系及机制有待于更进一步的研究，G-6-Pase或许参与了生理状态下visfatin调节机制。

综上所述，糖尿病大鼠肝组织visfatin的表达明显升高，可能与胰岛素抵抗及糖尿病发生有关，visfatin可能激活了胰岛素受体而发挥降糖作用，但visfatin在糖尿病及胰岛素抵抗机制中具体作用如何，还有待于对其进行更深入的研究。

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