微生物药物合成的放线菌底盘

池淏甜 王连荣（武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，武汉 430071）

微生物药物合成的放线菌底盘

池淏甜 王连荣
（武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，武汉 430071）

王连荣，武汉大学药学院教授，主持新世纪优秀人才计划、国家自然科学基金委项目等科研基金。主要致力于DNA磷硫酰化修饰这一新型表观遗传的修饰特征以及功能研究。

E-mail:lianrong@whu.edu.cn

合成生物学作为一门新的工程科学已然成为全世界关注的焦点。与传统的研究手段不同，合成生物学以工程化的思想引导人们有针对性地设计、制造各种元件和体系，将多样的“生物砖”按“设计图”组装并在适当的底盘体系中有效地生产造福人类的新药物、化学制品和燃料等，以解决现在所面临的健康、能源、材料、环保等问题。文章简述了合成生物学的三大飞跃进展、生物底盘构建的研究进展以及放线菌底盘在微生物药物合成方面的研究进展。

1 合成生物学的研究进展

“合成生物学”这个名词很早就已出现，直到2000年E.Kool在美国化学年会上重新提出使其得到真正的发展。2012年2月，合成生物学被世界经济论坛（WEF）评为对世界影响最大、最有可能为全球面临的挑战提供答案的十大新兴科学技术之一 。这几年，合成生物学的快速进展，使自然界中生物体蕴含着巨大潜能的开发利用成为可能。人们可以使用新的生物反应进程和生物体，来实现一些特殊的目的，如将生物量（一切直接或间接利用绿色植物光合作用形成的有机物质）转化成化学物质、燃料或者其他材料，研发新的治疗药物保护人体免受伤害 。合成生物学飞跃性发展主要分为三大类：工程工具、生物底盘、合成的微生物菌群。

1.1 工程工具——生物砖

在基础工程工具范畴内，2000年发生了两个具有标志性的飞跃，科学家创造了可以和任何生物系统协调的基本生物元件。以普林斯顿大学的科学家Michael Elowitz和Stanislas Leibler为首的团队研发了一个由3个连锁基因组成的振荡器，它可以调控某些蛋白的产生 。另一个团队是以波斯顿大学的科学家James Collins为首，他们让成对的两个基因组成一个拨动开关，即每个基因倾向于关闭另一个基因 。对于工程师来说，这样的振荡器和拨动开关是最基本的工具，但在生物学家看来，这是第一个以可预测的方法来调控生物系统的可靠手段。

随着越来越多的生物元件被开发，麻省理工学院在2003年成立了“标准生物组件登记册”以促进生物元件的分享与使用。2006年，麻省理工学院的Tom Knight和他的合作者发起了“生物砖基金会”，确保了生物元件管理的安全性和可靠性，使生物元件的标准化顺利推进。目前这些“生物砖”的数量已达一万种且免费供应。麻省理工学院举办的年度国际基因工程竞赛（iGEM）更是吸引了世界各地的大学生用“生物砖”组装出多种多样且充满创意的产品，如美国加州大学伯克利分校的学生创造了Bactoblood，可以利用大肠杆菌制造血红细胞替代物，英国剑桥大学的小组创造了一种对于特定诱导物的不同级别能够产生不同颜色色素的微生物 。

1.2 生物底盘

另一些研究则更注重整体，期望设计和构建能够执行设定任务的生物底盘。人为创造的生物底盘除了基因组不断精简外，还必须具有稳定的代谢平衡，正常的细胞生殖和进化能力。目前，生物底盘的构建主要有两种技术路线：自下而上全合成简约化的基因组；自上而下剔除赘余基因以达成基因组的简约化。自下而上的技术路线是基于合成生物学与传统的生物学完全相反的研究方法，它是将多年以来对生物体系研究所获得的知识和技术结合起来从最基本的要素开始将零部件一步步建立成生物体，重塑生命是其核心思想 。2010 年5月20日，D.G. Gibson和他的同事 在文特研究所宣布：世界上第一个由纯人工合成创造的细菌物种“Synthia”诞生了。这一实验结果证明了人工创造生物的可能性和实践性。他们将M. mycoides （donor细菌B）的DNA序列解码并拷贝到电脑中，设计并化学合成了平均6kb 的DNA链，通过同源重组等方法最终组装得到1.08Mb的基因组。同时消除Mycoplasma capricolum（细菌A）的细胞核，然后将组装好的细菌B的DNA移植到细菌A的细胞中并激活它。这个令人兴奋的成果是在花费了40 000 000美元和15年的等待后得到的，所以采用生物技术仍是现在最为流行手段去构建一个“人工合成细胞工厂”。这项研究成果有助于更深入了解生命的起源和生物进化。

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自上而下的技术路线，主要是针对遗传背景已经研究的较为清晰的宿主。通过分析基因组的结构和序列，把非必需或赘余的基因序列分批次敲除，使宿主的基因组适度精简，去除或减小非必需代谢途径和复杂调控网络的干扰，使细胞代谢途径得以优化，细胞对底物和能量的利用率以及细胞的生产性能均得到改善，细胞生理性能的可预测性和可控性显著提高 。关于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、链霉菌等模式菌株的简约化基因组的研究工作已有报道 。

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1.3 合成的微生物菌群

多细胞微生物菌群的互相作用模型和其潜在的分子机制的研究是合成生物学开拓的新领域 。基于系统生物学对多细胞生理过程和相互作用的理解，合成的微生物菌群被广泛用于仿生计算、化合物和生物能源的生产、药物和人类健康以及环境等方面。尤其在微生物药物方面，合成的微生物菌群主要用于糖核苷酸和低聚糖、肿瘤治疗的生物药品、占全球市场数十亿的抗血凝剂和疫苗的大规模工业生产中～。

在营养制剂方面，K.vulgare和B. megaterium组成的微生物菌群通过两步发酵工艺可以用于维生素C的工业生产 。第一步Gluconobacter oxydans将D-sorbitol转化为L-sorbose，共培养菌K.vulgare和B.megaterium在第二步中将L-sorbose转化成2-keto-L-gulonic acid（2-KLG, 维生素C的前体物）。由于共培养可以加强两株菌在氨基酸利用时的合作，共培养菌多次传代后发现2-KLG的产量增加了16%。共培养菌中维生素C生产的系统学分析数据（基因组学、蛋白质组学、代谢组学）给之后的优化提供了重要信息。Du等 利用这些数据对K.vulgare维生素C的生产途径进行了设计、重建和优化，将9个重组克隆转化入K.vulgare后，2-KLG产量增加了20%。在生物药品方面，Koizumi等 研发了一个将乳清酸转化成UDP-galactose和globotriose的大规模生产体系。这个合成的微生物菌群主要由两个大肠杆菌重组体和产氨短杆菌（Corynebacteriumammoniagenes）组成。表达galT，galK，galU和ppa的E. coli M522/pNT25/pNT32将半乳糖转化为UDP-Gal，接着表达IgtC的E. coli NM522/pGT5将乳糖和UDP-Gal转化为globotriose，C.ammoniagenes DN510将乳清酸转化成UTP，而UTP反过来又将被E. coli M522/pNT25/pNT32代谢转化。此外，还有其他低聚糖也用类似方法进行大规模工业生产，这些研究包括生态学、系统生物学分析、化学途径的设计、基因工程等多学科交叉内容，进一步表明合成生物学在生物药物研发和工业化生产中的巨大潜力 。

2 生物底盘的研究进展

随着分析方法和实验技术的不断创新，生物底盘成为合成生物学的研究热点之一，越来越多的研究集中在如何构建一个更容易预测和控制的生物底盘上，因此很多国家纷纷启动相关的研究计划。欧洲的第五个框架计划中，1998～2002年进行“细胞工程”计划。这个项目旨在全面研究、了解微生物在应用领域中的使用。其中杰出的研究成果是将枯草芽孢杆菌的分泌系统概括为“secretome” 。2002年，美国能源部（DOE）科学局开始基因组到生命（GTL）计划。这个计划旨在通过计算机模拟和体外实验创造一个人造细胞。GTL计划的一个重要部分是研究合成基因组学，John Craig Venter和他的同事试图创造人工最小基因组用于能量生产和其他应用 。2001年，日本由经济、贸易和工业部（METI）及新能源和工业技术研发机构（NEDO）联合开展了细胞工厂项目即基因组简约化工厂（MGF）项目。在这个项目中，通过运用基因组工程和分析几种模式菌株的功能基因组学，构建含有可用于工业用途的必需基因的最小基因组微生物。大肠杆菌基因组精简幅度高达38.9%，枯草芽胞杆菌和阿维链霉菌的基因组精简为18%～23%，其他微生物基因组精简程度低于10%。

大肠杆菌是最好的基因重组宿主之一。20世纪80年代开始，大肠杆菌生产的商业产品就被用于医药和发酵工业，如重组蛋白、氨基酸和其他化学制品 。2002年发表了第一篇大肠杆菌基因组简约化的报道 。菌株MG1655中8.1%（376kb）的序列通过将λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统与双链断裂重组修复系统相结合的方法被连续大片段删除。随后，Posfai等 报道大肠杆菌菌株MDS42中15%的基因组序列（0.71Mb）被有计划地连续删除，消除所有IS序列和毒性基因。与亲代菌株MG1655相比，MDS42细胞生长和蛋白表达均正常，并且基因组的精简使菌株具备了意想不到的优良属性，如细胞电穿孔效率显著增加。另一个大肠杆菌菌株MGF-01，基因组精简比例达到22%（1.03Mb） 。MGF-01在基本培养基中的生长速率与亲代菌株W3110一样，此外在野生型菌株生长达到到固定相时MGF-01还在持续增长。MGF-01分泌的苏氨酸量为野生型菌株的两倍。

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枯草芽孢杆菌是研究最广泛的模型微生物之一，在工业领域被广泛应用于生产各种酶 。2008年，Morimoto等 分析了枯草芽孢杆菌中不编码RNA或基本蛋白质的序列片段（大于10kb），排除了部分初级代谢的基因，采用upp负选择标记的敲除技术，获得了简化菌株（敲除20.7%基因组，0.874Mb），菌株生长速率比野生型略微降低，但细胞形态和染色体分布基本保持不变。利用此菌株表达碱性纤维素酶及碱性蛋白酶的活性分别比野生株提高1.7和2.5倍。除了在原核生物中进行了一系列简化基因组的研究外，Murakami等 通过软件分析酿酒酵母染色体，排除已知必需基因及某些删除可能导致细胞致死、不利的基因，利用PCR介导染色体分裂技术，经过多步操作获得了缺失5%（531.5kb）的基因组简化菌株，此菌株的乙醇产量比野生型增加1.8倍，甘油产量增加2倍。

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3 放线菌底盘的研究进展

链霉菌是具有显著优良特性的微生物，可以产生多种在医药、农业和生物研究等方面具有重要价值的次级代谢物，包括抗生素和其他具有生物活性的物质。这些结构多样的代谢物不仅具备抗细菌、真菌、病毒和肿瘤的活性，而且还有免疫抑制和抗高血压的性能 。随着后基因组时代的来临，分子遗传学和基因工程的发展，以及基因组学和蛋白组学等学科的深入研究，链霉菌代谢途径的相关信息变得越发清晰，使得对次级代谢合成途径中涉及的一些蛋白的编码基因进行操控、改变生物合成途径变得可能。合成生物学在链霉菌领域的研究成为热点 ，链霉菌底盘的研究更为深入。

3.1 底盘的构建流程

链霉菌的基因组与其他原核生物相比较大，且形态分化和代谢途径也较为复杂 。2011年，Komatsu等 利用CreloxP重组系统分步缺失获得一系列阿维链霉菌基因组最简化菌株SUKA（精简比例高达16.88%～18.54%），并首次将最简化宿主用于异源表达次级代谢生物合成途径。阿维链霉菌9 025 608个碱基的全基因组测序在2003年完成 。分析发现线性染色体的复制起始位点（oriC）与中心区域偏移了800kb。与其他链霉菌的染色体做比对分析，显示有1个6～6.6Mb高度保守的核心区域，大部分必需基因位于这个区域中。另一方面，保守度较低的亚末端染色体区域主要分布在染色体末端，其中超过半数的基因都与次级代谢相关且没有发现必需基因的存在。此外，基因组中分析发现有111个基因编码转座酶，其中左右两个亚末端染色体区域各有87和13个。基于对阿维链霉菌染色体的深入分析，大片段缺失突变株SUKA2～22的基因组大小是7 509 588～7 352 064 bp，删除了1 516 020～1 673 544 bp。SUKA可以在无添加的基础培养基中正常生长，且不产生任何内源次级代谢物（阿维霉素、寡霉素、菲律宾菌素和萜类化合物）。由于消除了78%的转座酶基因和67%的IS序列，SUKA基因组的稳定性增加 。对于自上而下的技术路线，通用的构建流程是首先结合比较基因组学、实验数据和代谢、调控、信号网络模型确定必需基因。然后，选用合适的方法对非必需基因进行缺失得到简约化的底盘。

3.2 底盘的异源表达

为了证实SUKA是一个通用且高效的宿主，选取了20个可以合成不同次级代谢物的异源基因簇在SUKA中进行表达，囊括了氨基糖苷类、核苷类、多肽类、莽草酸酯衍生物和萜类化合物。其中，链霉素、头孢氨苄C以及大环内酯类抗生素pladienolide的合成相关基因簇分别导入突变株中并检测产物表达量，发现链霉素和头孢霉素C产量高于原产菌株，在导入调控基因pldR后，突变株可以合成pladienolide。同时，经密码子优化后的合成基因也可以在基因组简化的菌株中有效表达，菌株可以生产植物萜类合成中间前体物质（amorpha-4，11-diene） 。多种不同的次级代谢生物合成基因簇都可以在链霉菌底盘宿主中表达，且有的次级代谢物的表达量远高于原产菌，这些充分说明链霉菌底盘的系统兼容性强、基因组稳定性好，这也给未来的研究奠定了良好的基础。

3.3 生物砖对底盘的影响

链霉菌底盘如同坚实的地基，如何构建一个别具一格的建筑，需要将“生物砖”按照设计者的意愿搭建到这个底盘中。底盘细胞染色体非必需区域缺失后并不一定会出现如同阿维链霉菌底盘一样的优良性能，这就需要将特殊功能的“生物转”按照设计者的需要装载到底盘中对其进行优化，使其获得更强的系统兼容性、更快的生长速率，且能够对药物合成途径进行高效转化。Streptomyces sp. FR-008中转入一系列优势前体基因，包括全局正调节基因（adpA）、透明颤菌氧血红蛋白基因（vgb）、硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因（metK），与对照野生型FR-008相比，前体基因的导入都使杀念菌素的产量得到了提高 。这为后续在底盘FR-008中实现其他微生物药物量产、优产提供了条件。Ikeda在SUKA中用编码核糖体蛋白S10的基因rpsJ（sav4925）的启动子成功表达了多个调节基因和异源的生物合成基因簇 。单分子红色荧光蛋白（mRFP1）报告系统可以检测到链霉菌中蛋白的定位。多样的报告系统作为一种有效的工具用于链霉菌中基因表达的研究，可以用于检测沉默的次级代谢基因簇是否被激活 ，以此可以发掘出更具价值的新型生物药物。2012年，美国生物结构实验室（BAL） 的研究小组开发出突破性的技术，他们将藻酸盐的代谢生物途径以及胞外解聚的工程化体系整合到基因组中，得到一个可以同时降解、吸收并代谢藻酸盐的生物底盘。这个生物底盘可以从海藻中提取所有主要的糖类并将这些糖类转变成可再生燃料和化学品，从而使海藻成为具有成本效益、可再生的生物质能源。

4 总 结

合成生物学的最新进展为更好地操纵生命提供了必要的工具。从基础的工程元件、生物底盘到多细胞菌群的深入研究，不仅储备了更多更优良的工具去创造人工生物系统，而且加深了对生命体的认识。随着知识和信息的不断积累，思想和实验手段才能进一步革新。

合成生物学让人们认识到了重塑生命的重要性。如何构建一个各方面性能优良的微生物底盘就显得非常重要。基因组简约化的底盘并非是基因组越小越好，最重要的是如何在基因组精简的同时具有比原始菌株更加优良的性能。在传统的“往外丢”的基础上，更需要“往里加”，即在简约化的底盘中加入各种生物元件以此提升自身性能，确保优质底盘的系统兼容性强、生长速度快、转化效率高、抗逆抗污染能力强等特性。天然药物的优势前体调控因子和一些修饰基因引入生物底盘中能够提高天然药物产量或增强基因组的稳定性。以这样的优质底盘为基础，异源组装的代谢途径才能得到最大程度的表达，也更有利于研究底盘与异源元件之间的适配性。

［本研究得到科技部“973计划”课题（2012CB721004）资助。］

■ 反馈服务编码 W3615

10.3969/j.issn.1674-0319.2015.06.004