复方依达拉奉注射液抗脓毒症作用及机制研究

魏安琪，刘成全，张正平，陈 荣，马世平*

中国药科大学1中药药理学教研室，2生理学教研室，南京211198；3江苏欧威医药有限公司，南京 210042

复方依达拉奉注射液抗脓毒症作用及机制研究

魏安琪1，刘成全2，张正平3，陈 荣3，马世平1*

中国药科大学1中药药理学教研室，2生理学教研室，南京211198；3江苏欧威医药有限公司，南京 210042

目的：研究复方依达拉奉注射液对脓毒症体内及体外模型的影响。方法：将130只SD大鼠随机分为7组：假手术组（Sham）、模型组（Model）、依达拉奉低剂量组（3 mg·kg-1）、依达拉奉高剂量组（6 mg·kg-1）、复方依达拉奉低剂量组（3.75 mg·kg-1）、复方依达拉奉高剂量组（7.5 mg· kg-1）、冰片组（给予2-莰醇1.5 mg·kg-1）；除假手术组10只外，每组均为20只。Sham组仅开腹不结扎，其余组均采用盲肠结扎穿孔术建立大鼠脓毒症模型。术后30 min、4 h、12 h分别交叉循环尾静脉注射相应的药物，假手术组与模型组给予生理盐水。术后6 h，检测血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和总胆红素（TBIL）水平，并观察动物24 h生存率。采用LPS刺激小鼠RAW 264.7巨噬细胞建立炎症模型，在不同浓度的依达拉奉注射液（E3：333 μmol·L-1），复方依达拉奉注射液 （E3B3：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片333 μmol·L-1、E3B4：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片1000 μmol·L-1）和冰片（B3：333 μmol·L-1、B4：1000 μmol·L-1）作用下，检测白介素6（IL-6）的浓度及环氧酶2（COX-2）蛋白的表达。结果：对比于假手术组、模型组动物血清炎症因子（TNF-α、IL-6）水平显著升高（P＜0.01），肝功能指标（AST、ALP、TBIL）也明显增加（P＜0.05）；复方依达拉奉注射液能明显降低血清TNF-α、IL-6、AST、ALP水平（P＜0.05），对血清TBIL水平也具减缓作用。依达拉奉、冰片和复方依达拉奉均可降低细胞上清液IL-6、COX-2蛋白水平，以复方依达拉奉最优。结论：复方依达拉奉注射液可能通过抑制COX-2，降低促炎因子的产生，缓解肝脏的损伤而起到抗脓毒症的作用，且优于单方依达拉奉和冰片。

复方依达拉奉注射液；脓毒症；炎症因子；肝损伤

脓毒症是感染引起的全身炎症反应，进一步可发展为脓毒性休克、多器官功能障碍综合症（MODS）、多器官功能衰竭（MOF）等，是严重创伤、烧伤、休克、大手术后的常见并发症和主要死亡原因之一[1]。据SPRUNG和MATOT统计数据显示[2]，美国每年有75万名脓毒症患者，重症监护病房中约40%患者发生脓毒症，其中，存活率仅为30%～50%。脓毒症的高发病率及高死亡率已经给社会和家庭带来了重大的负担。

研究发现[3-5]，脓毒症MODS脏器功能损伤的发生有其相对规律性，其中肝脏是损伤发生较早、频率较高的脏器，伴随肝细胞的功能丧失可能诱导多器官功能衰竭，脓毒症危重患者一旦出现“肝功能损害-能量代谢障碍-自身抵抗力下降-脓毒症加重-肝功能障碍进一步加剧”的级联反应，预后较差，若发生更严重的肝损伤，死亡率几乎达100%。

复方依达拉奉注射液（compound edaravone in-jection，C.EDA）[6]是依达拉奉和冰片的组合物，是全球首个临床用于缺血性脑卒中治疗的复方制剂。研究表明[7-11]，依达拉奉（edaravone，EDA）是一种合成的自由基清除剂，不仅可以清除羟自由基（自由电子处于氧上），还可以抑制铁诱导的氧化应激反应，并且在心肌及肝脏缺血再灌注损伤领域有一定的疗效，也可使内毒素致急性肝损伤的大鼠死亡率下降；而冰片（borneol，BOR）具有良好的抗炎、抗氧化效果。本实验采用内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7细胞复制炎症体外模型，盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）复制大鼠脓毒症体内模型，拟进行以下两个方面的研究：①研究复方依达拉奉注射液对脓毒症大鼠死亡率及肝损伤的影响；②研究其对抗脓毒症作用机制的初步探讨。

1 材料

复方依达拉奉注射液，临床应用制剂，5 mL/支，批号：S-83-130327，南京先声东元制药有限公司产品；实验时，需用灭菌生理盐水稀释，分别配制成低剂量（3.75 mg·kg-1，L.C.EDA）和高剂量（7.5 mg·kg-1，H.C.EDA），现配现用。依达拉奉注射液，临床应用制剂，5 mL/支，批号：80-130903，南京先声东元制药有限公司产品；实验时，需用生理盐水稀释，分别配制成低剂量（3 mg·kg-1，L.EDA）和高剂量（6 mg·kg-1，H.EDA），现配现用。2-莰醇（1.5 mg·kg-1）是天然冰片的主要成分（≥95%），本实验室自行制备。氯化钠注射液，批号：A13080501-2，四川科伦药业股份有限公司产品；水合氯醛（AR），批号：20130201，国药集团化学试剂有限公司产品；碘伏消毒液，批号：20130902，德州安捷高科消毒制品有限公司产品；LPS，Sigma，批号：L2630-100MG；澳洲胎牛血清（FBS），Gibco，批号：10099141；高糖DMEM培养基，Gibco，批号：SH30022.01B；anti-COX，Santa Cruz，货号：sc-1745；anti-GAPDH，货号：AG019，购自碧云天生物技术研究所。

大鼠TNF-α（货号：ER006-96，批号：ZDZG-BZAC01）、IL-6（货号：ER003-96，批号：ZAZ-IBZAC01）ELISA测定试剂盒均购自上海依科赛生物制品有限公司；AST（批号：0812131）、ALP（批号：0612091）测定试剂盒均购自四川迈克生物科技股份有限公司；TBIL（批号：112101L）购自北京利德曼生化股份有限公司。

2 方 法

2.1 体内实验

2.1.1 动物及分组 SPF级SD大鼠，雄性，体重260～300 g，共130只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2014-0001。动物分笼饲养，保持12 h昼夜节律，室温22℃±1℃，自由饮水摄食。适应性饲养1周后按体重随机分为7组，分别为假手术组（给予生理盐水），模型组（给予生理盐水），L.EDA（3 mg·kg-1）组，H.EDA（6 mg·kg-1）组，L.C.EDA（3.75 mg·kg-1）组，H.C.EDA（7.5 mg·kg-1）组，BOR（给予2-莰醇1.5 mg·kg-1）组。除假手术组10只外，每组均为20只。

2.1.2 模型制备及给药 术前禁食12 h，按6 mL· kg-1剂量的7%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，麻醉后固定、腹部脱毛、消毒、铺无菌洞巾。沿腹正中线作1.5 cm切口，找到盲肠，仔细剥离肠系膜，在盲肠2/3处用5～0号医用真丝线结扎盲肠（避免结扎全盲肠及盲肠系膜血管）。用18号针头穿刺盲肠1次，挤出少量肠内容物。再将盲肠归纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，术毕，立即皮下注射37℃灭菌生理盐水（置于37℃水浴锅中）50 mL·kg-1抗休克[12]。假手术组仅开腹不结扎，其余步骤均相同。

术后30 min、4 h、12 h分别交叉循环尾静脉注射相应的药物。

2.1.3 存活率检测 术后观察24 h的存活率，每6 h观察一次，记录动物死亡时间。观察期结束后，统计各组的存活率。

2.1.4 血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）检测 根据体外炎症及体内存活率实验，结果显示，复方依达拉奉药效优于依达拉奉和冰片的单独给药，进而单独进行复方依达拉奉注射液的深入研究。重复盲肠结扎穿孔术，分假手术组、模型组、复方依达拉奉低、高剂量组，共4组，每组6只，给药剂量及时间同“2.1.3”，术后6 h进行腹主动脉取血，室温静置30 min，3000 r·min-1离心5 min，取上清液，严格按照试剂盒方法测定TNF-α、IL-6含量。

2.1.5 肝损伤评估 通过血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和总胆红素（TBIL）的水平检测，得知肝损伤的程度。动物分组、给药及血清样本同 “2.1.4”，严格按照试剂盒方法测定AST、ALP及TBIL含量。

2.2 体外实验

2.2.1 细胞培养 小鼠巨噬细胞RAW 264.7由南京师范大学殷志敏教授赠予，加入含体积分数10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的完全DMEM培养基，置于体积分数5%CO2、37℃培养箱中传代培养。取生长良好的RAW 264.7细胞，PBS冲洗后吹散，调整细胞浓度为5×104/mL，接种于96孔细胞培养板，待其生长至80%融合后，加入不同浓度的EDA（E3：333μmol·L-1），C.EDA（E3B3：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片333 μmol·L-1、E3B4：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片 1000 μmol·L-1）和BOR（B3：333 μmol·L-1、B4：1000 μmol·L-1）孵育2 h，再加入LPS（1μg·mL-1）进行刺激。

此前，进行了复方依达拉奉对RAW 264.7细胞的毒性及药效预实验，结果显示：在最小毒性的前提下，浓度为333 μmol·L-1的依达拉奉能达到最大药效；而冰片则剂量依赖性地增加细胞活性。所以此次实验分组如下：正常对照组、LPS组、LPS加EDA（E3：333 μmol·L-1）组、LPS加C.EDA（E3B3：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片333 μmol·L-1、E3B4：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片1000 μmol·L-1）组、LPS加BOR（B3：333 μmol·L-1、B4：1000 μmol·L-1）组。

2.2.2 细胞因子浓度测定 巨噬细胞RAW 264.7先给予各浓度EDA（E3：333 μmol·L-1），C.EDA（E3B3：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片333 μmol·L-1、E3B4：依达拉奉333 μmol·L-1加冰片1000 μmol·L-1）和BOR（B3：333 μmol·L-1、B4：1000 μmol·L-1）作用2 h，再加入LPS（1μg·mL-1），同时设正常对照组和LPS组，培养24 h后，检测各组细胞培养上清液白介素6（IL-6）的浓度。操作步骤严格按试剂盒说明书完成。

2.2.3 环氧酶2（COX-2）蛋白表达 吸弃培养基，用预冷PBS洗1遍，加入RIPA（强）裂解液，冰上裂解20 min，收集裂解液，4℃、10000 g离心收集裂解液上清，BCA定量并调整到总蛋白浓度为1 mg·mL-1。取适量加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮样5 min，1000 r·min-1离心5 min。取20 μL加入分离胶浓度为12%的凝胶中进行SDS-PAGE。最后置于Alpha凝胶成像系统中进行ECL成像分析。

2.3 统计分析

3 结 果

3.1 复方依达拉奉对脓毒症大鼠生存率的影响

与模型组相比，治疗组动物术后24 h死亡率显著降低。其中，假手术组生存率为100%；模型组生存率为20%（死亡16只）；依达拉奉低剂量组生存率为25%（死亡15只），高剂量组生存率为35%（死亡13只）；复方依达拉奉低剂量组生存率为35%（死亡13只），高剂量组生存率为45%（死亡11只）；冰片组生存率为25%（死亡15只）。结果见表1。

表1 复方依达拉奉注射液对脓毒症大鼠生存率的影响（n=10/20）

3.2 复方依达拉奉对脓毒症大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响

各组血清TNF-α、IL-6水平比较，模型组均显著高于假手术组（P＜0.01）；与模型组相比，治疗组动物术后6 h血清TNF-α、IL-6水平均显著降低 （P＜0.05）。结果见表2。

表2 复方依达拉奉对脓毒症大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响（±s，n=6）

表2 复方依达拉奉对脓毒症大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响（±s，n=6）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05

组别剂量（mg·kg-1）TNF-α（ng·L-1）IL-6（ng·L-1）假手术组-84±10 163±27模型组-251±100##780±142##低剂量组3.75 110±24*406±120**高剂量组7.5 97±20**374±70**

3.3 复方依达拉奉对脓毒症大鼠肝功能的影响

各组血清AST、ALP、TBIL水平比较，模型组均显著高于假手术组（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组动物术后6 h血清AST、ALP、TBIL水平均降低，其中，复方依达拉奉高剂量组AST、ALP水平显著降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 复方依达拉奉对脓毒症大鼠肝功能的影响（±s，n=6）

表3 复方依达拉奉对脓毒症大鼠肝功能的影响（±s，n=6）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.05

组别剂量（mg·kg-1）AST（u·L-1）ALP（u·L-1）TBIL（μmol·L-1）假手术组-285±12 250±56 2.43±0.5模型组-349±51.2#332±53#8.2±6#低剂量组3.75 343±38.4 288±39 4.5±1.3高剂量组7.5 293.7±131*262±49*4±1.54

3.4 复方依达拉奉对RAW炎症细胞IL-6水平的影响

在正常情况下，巨噬细胞RAW 264.7培养上清液IL-6含量极低，当用1 μg·mL-1LPS刺激后，其IL-6的表达明显增高（P＜0.01）。三种受试药物均能抑制LPS诱导的炎症反应，复方依达拉奉最优。结果见图1。

图1 复方依达拉奉对LPS诱导的IL-6表达的影响（n=3）

3.5 复方依达拉奉对LPS诱导RAW264.7炎症细胞表达COX-2的影响

复方依达拉奉和LPS处理24 h后收集细胞，提取蛋白，经Western blot检测，模型组的COX-2蛋白表达明显高于空白对照组（P＜0.01）；三种受试药物除B3、B4外均能抑制由LPS诱导的COX-2蛋白表达。其中，复方依达拉奉最优。结果见图2。

图2 复方依达拉奉对LPS诱导RAW炎症细胞表达COX-2的影响（n=3）

4 讨 论

体内模型的建立是通过盲肠结扎穿孔术，将腹膜微生物菌群渗入腹膜引起的感染，肠内细菌置换入血后，会触发系统性炎症应答，特点是一致性及重复性较好，其模拟病理特点及发病进程变化等与人类脓毒症相似，已成为国内外研究脓毒症的发病机制而广泛应用的动物模型之一[12-13]。本实验参照文献方法，利用中等强度的盲肠结扎穿孔术进行造模。结果显示，与假手术组比较，模型组动物生存率显著降低，炎症因子TNF-α、IL-6升高及肝脏病理性损害，处死动物剖腹后可见明显的盲肠肿胀，腹腔内大量脓血性渗出液，表明盲肠结扎穿孔术造模成功。而通过复方依达拉奉注射液的给予，可明显逆转生存率、炎症因子及肝功能的异常改变，且效果优于单方的依达拉奉和冰片。

脓毒症的病理机制复杂，炎症因子和炎症介质的大量释放和活化是其基本损害之一[14,15]。肿瘤坏死因子α（TNF-α）主要由单核巨噬细胞、淋巴细胞等分泌，是炎症的最初启动者，通过促进细胞产生IL-1、IL-6等细胞因子，从而发生细胞因子的级联反应；白介素6（IL-6）可通过介导多种免疫细胞参与脓毒症早期的炎性反应，影响器官的功能，脓毒症早期患者血浆IL-6水平明显升高；前列腺素是炎症反应的重要介质，环氧酶2（COX-2）作为环加氧酶途径的诱导酶能产生大量的前列腺素类物质，介导炎症反应[16-18]。本实验中，LPS显著提高炎症细胞IL-6浓度及COX-2蛋白表达，而造模同时给予复方依达拉奉注射液，炎症细胞IL-6浓度及COX-2蛋白明显下降；盲肠结扎穿孔术显著升高动物血清TNF-α、IL-6水平并降低其生存率，而造模同时给予复方依达拉奉注射液的动物，血清TNF-α、IL-6水平明显降低，生存率也显著提高。提示复方依达拉奉注射液可能通过调控炎症因子的产生而提高生存率，达到抗脓毒症的作用。

此外，有文献报道[19]，脓毒症的死亡率与终末器官（肝、肾）的损伤呈正比关系。本实验研究发现，复方依达拉奉注射液可降低模型大鼠血清AST、ALP、TBIL水平，而这三者均是反映肝脏功能的重要指标，提示复方依达拉奉注射液可能通过降低肝损伤而提高生存率，达到抗脓毒症的作用。

综上所述，复方依达拉奉注射液对盲肠结扎穿孔致脓毒症动物模型具有明显的保护作用，其效果优于依达拉奉及冰片的单独给药，其机制可能是通过抑制COX-2的表达，降低促炎因子的产生，缓解肝脏的损伤而起到抗脓毒症的作用。

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Anti-sepses Effect of Compound of Edaravone and Its Possible Mechanism

WEI An-qi1,LIU Cheng-quan2,ZHANG Zheng-ping3,CHEN Rong3,MA Shi-ping1*
1Department of Pharmacology of the Traditional Chinese Medicine,2Department of Physiology,China Phar-maceutical University,Nanjing 211198;3Jiangsu Simovay Pharmaceutical Co.Ltd.,Nanjing 210042

Objective:To explore the Compound of edaravone injection (C.EDA)on sepsis in vivo and in vitro models.Methods:One hundred and thirty SD rats were randomly divided into seven groups:sham operation group,model group,low-EDA group(L-EDA,3 mg·kg-1),high-EDA group(H-EDA,6 mg·kg-1), low-C.EDA group(L-C.EDA,3.75 mg·kg-1),high-C.EDA group(H-C.EDA,7.5 mg·kg-1)and borneol group (BOR,1.5 mg·kg-1)with 20 rats in each group except the sham group.The septic rat models were estab-lished with cecal ligation and puncture except the sham group,the later accepted only laparotomy without ligation.At 30 min,4 h and 12 h after the surgery,drugs were administered alternately and circularly by tail vein injection,rats in the sham and model groups were given physiological saline.The concentrations of serum tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6),aspartate aminotransferase(AST),alkaline phosphatase(ALP)and total bilirubin(TBIL)were measured 6 h after the surgery,and the mortality of each group were recorded 24 h after the surgery too.RAW 264.7 cells were pretreated with LPS 1 μg to set up the inflammatory model,various concentrations of EDA(E3:edaravone 333 μmol·L-1),C.EDA(E3B3:edar-avone 333 μmol·L-1plus borneol 333 μmol·L-1;E3B4:edaravone 333 μmol·L-1plus borneol 1000 μmol·L-1) or borneol(B3:borneol 333 μmol·L-1;B4:borneol 1000 μmol·L-1)were administered to explore their effects on the production of IL-6 and the expression of COX-2 in these LPS-stimulated cells.Results:Compared with the sham operation group,the levels of serum inflammatory factors (TNF-α,IL-6)increased signifi-cantly (P＜0.01),the liver function (AST,ALP,TBIL)was also raised (P＜0.05)in the model group.The levels of serum TNF-α,IL-6,AST and ALP in the C.EDA group were notably lower than those in the model group (P＜0.05),the level of serum TBIL decreased slowly compared with the model group.EDA, BOR and C.EDA could decrease the activity of IL-6 and COX-2 in cell supernatant,and C.EDA was the best.Conclusion:C.EDA has antisepsis effects possibly by inhibiting the production of COX-2 and proin-flammatory factors and attenuating hepatic injury,and it is superior to EDA and BOR.

Compound of edaravone injection(C.EDA);Sepsis;Inflammatory factors;Hepatic injury

R965.1

A

1673-7806（2015）02-114-05

魏安琪，女，硕士研究生，研究方向：中药药理学E-mail:wei199204@126.com

*通讯作者马世平，男，教授，博士研究生导师，研究方向：中药及复方药理 E-mail:spma@cpu.edu.cn

2015-01-12

2015-01-30