脑胶质瘤组织中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1和Rac GTP酶激活蛋白酶1蛋白的表达及其临床意义

王永胜，王宗宝，孙灵梅，夏家林

·短篇论著·

脑胶质瘤组织中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1和Rac GTP酶激活蛋白酶1蛋白的表达及其临床意义

王永胜，王宗宝，孙灵梅，夏家林

目的检测脑胶质瘤组织中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)和Rac GTP酶激活蛋白酶1 (Rac1)蛋白的表达，并探讨二者与脑胶质瘤病理分级和生存的关系。方法收集滨州市中心医院神经外科2007年6月—2012年7月手术切除并经病理证实的脑胶质瘤标本58例，按照世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤2007年分类标准分组:低级别组21例，中级别组17例，高级别组20例;另选择同期14例正常脑组织标本作为正常对照组。应用免疫组化SP法检测各组标本中Tiam1和Rac1蛋白的表达情况。并对脑胶质瘤患者进行随访，进行Kaplan－Meier生存曲线分析。结果Tiam1和Rac1蛋白的阳性表达率比较，高级别组＞中级别组＞低级别组＞正常对照组(P＜0．05)。脑胶质瘤组织中Tiam1和Rac1蛋白的表达呈正相关(r=0．328，P＜0．05)。Kaplan－Meier生存曲线分析显示:Tiam1蛋白表达阳性患者的半数生存期为19个月，Tiam1蛋白表达阴性患者的半数生存期为45个月;Rac1蛋白表达阳性患者的半数生存期为17个月，Tiam1表达阴性患者的半数生存期为42个月。脑胶质瘤组织中Tiam1和Rac1蛋白表达阴性者较表达阳性者具有生存优势(P＜0．05)。结论Tiam1和Rac1蛋白在脑胶质瘤组织中呈高表达，且与脑胶质瘤病理分级和生存期密切相关，联合检测Tiam1和Rac1蛋白表达可作为脑胶质瘤增殖能力、恶性程度及生存期的预测指标。

胶质瘤;T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1;Rac GTP酶激活蛋白酶1;病理分级;生存期

王永胜，王宗宝，孙灵梅，等．脑胶质瘤组织中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1和Rac GTP酶激活蛋白酶1蛋白的表达及其临床意义［J］．实用心脑肺血管病杂志，2015，23(1):82－84．［www．syxnf．net］

Wang YS，Wang ZB，Sun LM，et al．Protein expressions of Tiam1 and Rac1 in brain glioma and its clinical significance［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(1):82－84．

脑胶质瘤是发病率较高的颅内原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的40%。近年来，虽然脑胶质瘤在基础及临床研究方面取得较大进展，但其仍是致死率、致残率较高的恶性肿瘤之一。目前，关于脑胶质瘤发生、增殖和浸润转移的作用机制仍不十分清楚，可能与瘤细胞的抗凋亡作用有关。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1，Tiam1)是一种从小鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离出来的原癌基因，其参与癌基因表达，影响细胞去极化过程，调节细胞骨架重组，参与细胞增殖与凋亡等过程［1］。Rac GTP酶激活蛋白酶1(Rac GTPase activating protein 1，Rac1)是Rho GTP酶超家族成员之一，通过蛋白激酶调节某些转录因子的活性来调控肿瘤细胞的分裂周期和转录，对肿瘤的增殖、恶性转型、浸润转移及抗凋亡发挥着重要作用。目前，国内有关Tiam1和Rac1蛋白的表达与脑胶质瘤病理分级及生存的关系研究少见。本研究应用免疫组化SP法检测脑胶质瘤组织和正常组织标本中Tiam1和Rac1蛋白表达情况，探讨二者与脑胶质瘤病理分级和生存的关系，以期寻找一个预测脑胶质瘤恶性程度和生存期的指标。

1 资料与方法

1．1 一般资料收集滨州市中心医院神经外科2007年6月—2012年7月手术切除并经病理证实的脑胶质瘤标本58例，其中男37例，女21例;年龄24～67岁，平均46．3岁。均为首发病例，术前未行放化疗。按照世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤2007年分类标准分组:低级别组(因Ⅰ级脑胶质瘤例数较少，与Ⅱ级合在一起作为低级别组)21例，中级别组(Ⅲ级)17例，高级别组(Ⅳ级，均为胶质母细胞瘤) 20例。另选择同期14例正常脑组织标本作为正常对照组，均为颅脑损伤或脑出血后行颅内减压术患者。对58例脑胶质瘤患者进行上门或电话随访，随访6～68个月，平均(34．2 ±23．6)个月。

1．2 试剂与实验方法

1．2．1 试剂采用常规免疫组化SP法，免疫组化试剂盒(SP 9000 kit)和显色试剂盒(DAB kit)购自北京中杉生物技术有限公司，兔抗人Tiam1多克隆抗体和鼠抗人Rac1单克隆抗体为美国Santa Cru公司产品。

1．2．2 实验方法常规石蜡切片脱蜡并水化;3%过氧化氢溶液阻断、灭活内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗3×5 min;微波加热修复抗原，PBS冲洗3×5 min;正常羊血清工作液封闭37℃10 min后滴加一抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3 ×5 min;Tiam1和Rac1抗体稀释浓度分别为1 μg/ml和4 μg/ ml，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS冲洗3×5 min;滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育30 min，PBS冲洗3 ×5 min;DAB显色，自来水充分冲洗后，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1．3 结果判定标准Tiam1和Rac1蛋白在组织细胞的胞质内出现棕黄色染色为阳性，部分可出现在胞膜上。通过细胞染色强度和阳性细胞计数进行半定量分析。每张切片观察5个视野，判断标准［2］:背景清晰无色为阴性(－)，浅黄色细胞数≤10%为可疑阳性(±)，浅黄色细胞数＞10%为弱阳性(+)，棕黄色细胞数≥70%为强阳性(++);其中(－) (±)为阴性，(+)(++)为阳性。

1．4 统计学方法应用SPSS 14．0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验及四格表确切概率法;相关分析采用Spearman等级相关分析;患者生存时间分析采用Kaplan－Meier法。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组Tiam1和Rac1蛋白的表达情况正常对照组Tiam1蛋白的阳性表达率为14．3%(2/14)，Rac1蛋白的阳性表达率为7．1%(1/14);低级别组Tiam1蛋白的阳性表达率为47．6%(10/21)，Rac1蛋白的阳性表达率为42．9%(9/21);中级别组Tiam1蛋白的阳性表达率为70．6%(12/17)，Rac1蛋白的阳性表达率为76．5%(13/17);高级别组Tiam1蛋白的阳性表达率为90．0%(18/20)，Rac1蛋白的阳性表达率为85．0%(17/20)。Tiam1和Rac1蛋白的阳性表达率比较，高级别组＞中级别组＞低级别组＞正常对照组，差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．2 脑胶质瘤组织中Tiam1和Rac1蛋白表达的相关性Tiam1蛋白阳性组织中Rac1蛋白的阳性表达率为85．0%，Tiam1蛋白阴性组织中Rac1蛋白的阳性表达率为27．8%，Tiam1蛋白阳性组织中Rac1蛋白的阳性表达率高于Tiam1蛋白阴性组织，差异有统计学意义(P＜0．05，见表1)。Spearman等级相关分析结果显示，脑胶质瘤组织中Tiam1和Rac1蛋白的表达呈正相关(r=0．328，P＜0．05)。

表1 脑胶质瘤组织中Tiam1与Rac1蛋白表达的相关性分析(例)Table 1 Analysis of the correlation between the expression of Rac1 protein and Tiam1 in gliomas

2．3 脑胶质瘤组织中Tiam1和Rac1蛋白的表达及生存分析58例脑胶质瘤组织中，Tiam1蛋白表达阳性40例，阴性18例，Kaplan－Meier生存曲线分析显示:Tiam1蛋白表达阳性患者的半数生存期为19个月，Tiam1蛋白表达阴性患者的半数生存期为45个月，脑胶质瘤组织中Tiam1蛋白表达阴性者较表达阳性者具有生存优势(P＜0．05，见图1)。58例脑胶质瘤组织中，Rac1蛋白表达阳性39例，阴性19例，Kaplan－Meier生存曲线分析显示:Rac1蛋白表达阳性患者的半数生存期为17个月，Tiam1表达阴性患者的半数生存期为42个月，脑胶质瘤组织中Rac1蛋白表达阴性者较表达阳性者具有生存优势(P＜0．05，见图2)。

图1 不同Tiam1蛋白表达患者的生存曲线Figure 1 Survival curves of patients with different Tiam1 expression

图2 不同Rac1蛋白表达患者的生存曲线Figure 2 Survival curves of patients with different Rac1 expression

3 讨论

脑胶质瘤是中枢神经系统常见肿瘤，呈浸润性生长，具有高增殖性和高侵袭性，其侵袭转移是患者术后复发和死亡的主要原因。目前，脑胶质瘤的发生、发展、增殖及浸润转移机制仍不明确，随着脑胶质瘤基础与临床研究的进展，人们逐渐认识到原癌基因的激活或抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要环节，其发生、发展与多基因的异常表达密切相关。近年来研究发现，Tiam1、Rac1蛋白等是重要的肿瘤相关蛋白，其作为复杂信号转导通路中的一部分在众多恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。

Tiam1是荷兰学者Habets等［1］首先从鼠T淋巴瘤分离克隆出来的基因，是一个重要的肿瘤转移促进基因，属于Db1家族，具有多个磷酸化位点。研究表明，Tiam1在正常人的平滑肌细胞中表达水平中等，在心肌细胞、支气管上皮细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞及神经元中表达水平较低，而在其他正常组织细胞中基本不表达［3］。临床研究显示，Tiam1蛋白在乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤组织中阳性表达水平较高并与肿瘤的分化程度、侵袭转移等关系密切［4－5］。

Rac1是Rac亚家族成员之一，而Rac亚家族又是Rho GTP酶超家族的亚家族成员。Rho GTP酶是细胞内多条信号转导通路的关键分子，作为开关在胞内信号转导中发挥着重要作用，其在多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关，通过改变肌动蛋白细胞骨架的重组而参与细胞迁移。Rac1激活后可诱导质膜突起形成片状层状伪足，有助于细胞对周围环境的适应及确定细胞迁移的方向，还可促使细胞表面整合素家族向细胞头部聚集，将信号向胞内传递，参与细胞骨架的重组，为细胞迁移提供动力，从而促进肿瘤侵袭转移［6］。Rac1还可以通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶增加胞内超氧化物阴离子浓度，从而抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖［7］。

Tiam1基因表达产物能促进整合素介导的异型细胞之间、细胞与基质之间的相互作用，而高表达的Tiam1能持续活化Rho样蛋白，促进弹力纤维的形成及病灶黏附复合物的形成，参与信号转导，调节细胞骨架结构，影响细胞去极化过程，促进细胞运动和迁移，诱导肿瘤细胞浸润转移［8］。

马燕侠等［9］采用PCR及Western blot检测发现，Rac1的表达随着脑胶质瘤级别的升高而升高，高级别组Rac1 mRNA表达量最高，表明Rac1基因表达与脑胶质瘤恶性程度密切相关。但到目前为止，国内有关Tiam1和Rac1蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及其与病理分级和预后的关系的研究较少。本研究采用常规免疫组化SP法检测脑胶质瘤组织中和正常脑组织中Tiam1和Rac1蛋白的表达情况，结果显示Tiam1和Rac1蛋白的阳性表达率比较，高级别组＞中级别组＞低级别组＞正常对照组，提示Tiam1和Rac1蛋白的表达可作为反映脑胶质瘤增殖能力和恶性程度的参考指标。另外，本研究结果还发现Tiam1和Rac1蛋白在脑胶质瘤中的表达呈正相关，说明可能存在Tiam1－Rac1信号转导通路，两者协同参与了肿瘤浸润、转移等病理生理过程，在脑胶质瘤的侵袭转移中发挥着重要作用。

影响脑胶质瘤患者预后及生存期的因素较多，一些分子生物学指标可能影响脑胶质瘤的发生、发展及病理特征变化，而病理分级又与患者的生存与预后息息相关，因此分析相关分子生物学指标和临床病理特征与患者预后之间的关系具有较大的临床价值。本研究通过Kaplan－Meier生存曲线分析显示，Tiam1和Rac1蛋白表达与患者生存期密切相关，二者阳性表达的患者半数生存期明显低于二者均阴性表达的患者，说明二者的阳性表达可增加患者生存危险，有助于判断脑胶质瘤患者的预后。

总之，Tiam1和Rac1蛋白在脑胶质瘤中呈高表达，说明二者在脑胶质瘤的发生、发展、侵袭转移中发挥着重要的作用，该肿瘤标志物的检测有助于脑胶质瘤生物学行为的预测与预后的评价，且由于Rac1与肿瘤侵袭转移密切相关，Rac1可能成为抑制肿瘤转移的重要靶位，为胶质瘤的早期诊断和治疗提供一个新的途径。

［1］Habets GGM，Scholtes EH，Zuydgeest D，et al．Identification of an invasion－inducing gene，Tiam1，that encodes aproteinwith homology to GDP－GTP exchangers for Rho－like protein［J］．Cell，1994，77(4):537－549．

［2］Uozaki H，Horiuchi H，Ishida T，et al．Overexpression of resistance－related proteins(metallothioneins，glutathione－S－transferase pi，heat shock protein 27，and lung resistance－related protein)in osteosarcoma．Relationship with poor prognosis［J］．Cancer，1997，79(12):2336－2344．

［3］李新元，张建中．肿瘤侵袭诱导基因蛋白在正常及癌组织中的表达及意义［J］．中华病理学杂志，2000，29(4):294－295．

［4］Hou M，Tan L，Wang X，et al．Antisense Tiam1 down－regulates the invasiveness of 95D cells in vitro［J］．Acta Biochimica Et Biophysica Sinica，2004，36(8):537－540．

［5］王会河，黄光武，林玲，等．Tiam1基因在喉癌中的表达与意义［J］．临床检验杂志，2006，24(1):49－51．

［6］Etienne－Mannerille S，Hall A．RhoGTPases in cell biology［J］．Nature，2002，420(6916):629－635．

［7］Yang SF，Chen MK，Hsieh YS，et al．Antimetastatic effects of Terminalia catappa on oral caner via a down－regulatasis－associated proteases［J］．Food Chem Toxicol，2010，48(4):1052－1058．

［8］Qi Y，Huang B，Yu L，et al．Prognostic value of Tiam1 and Rac1 overexpressioninnasopharyngealcarcinoma［J］．ORLJ Otorhinolaryngol Relat Spec，2009，71(13):163－171．

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R 730．264

B

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．028

2014－07－15;

2014－12－24)

(本文编辑:谢武英)

251700山东省滨州市中心医院