长脂拟鲿种群Cytb基因序列的变异及遗传多样性

董 坡， 代应贵， 尹邦一

(贵州大学 动物科学学院， 贵州 贵阳 550025)



长脂拟鲿种群Cytb基因序列的变异及遗传多样性

董 坡， 代应贵*， 尹邦一

(贵州大学 动物科学学院， 贵州 贵阳 550025)

为给长脂拟鲿(Pseudobagrusadiposalis)的保护和利用提供科学依据，以采自珠江水系西江支流漓江、长江水系沅江上游支流氵舞阳河的长脂拟鲿各30尾为材料，研究该种鱼类种群细胞色素b(Cytb)基因序列变异及遗传多样性。结果表明：长脂拟鲿Cytb基因序列长1 096 bp。其中，氵舞阳河种群、漓江种群分别有6个和40个变异位点，分属6个和4个单倍型，单倍型多样性指数(Hd)分别为0.639和0.251，单倍型间平均遗传距离(P)分别为0.002 0和0.024 3，核苷酸多样性(Pi)分别为0.000 80和0.006 31。氵舞阳河种群Cytb基因序列有4个同义突变和2个非同义突变，漓江种群有37个同义突变和3个非同义突变。漓江与氵舞阳河种群Cytb基因序列共定义了10种单倍型，Hd为0.727，P为0.030 0，Pi为0.026 03。2个种群间的遗传分化指数(Fst)为0.817，基因交流值(Nm)为0.06。2个种群间出现了一定程度的分化，但未达到种群水平。

长脂拟鲿； 氵舞阳河； 漓江； Cyt b； 遗传多样性

长脂拟鲿(Pseudobagrusadiposalis)隶属鲇形目鲿科拟鲿属，主要分布于珠江水系西江、长江水系沅江以及台湾淡水河等[1-4]，是一种小型淡水经济鱼类。近年来，由于酷鱼滥捕、水域污染以及大量水坝的修建，该种鱼的自然分布区逐渐缩小，种群资源量急剧减少。线粒体DNA ( Mitochondrial DNA，MtDNA) 具有母性遗传、进化速度快、核苷酸替代率高等特点，已成为鱼类进化生物学和种群遗传学研究的重要遗传标记[5-6]。细胞色素b(Cytb)基因是MtDNA 上的蛋白质编码基因，其进化速度适中，适合种群水平差异的检测，是探讨种间和种内遗传分化程度的良好标记[7-9]。到目前为止，有关长脂拟鲿的研究大多局限于形态分类和地理分布方面；此外，Katsutoshi Watanabe等[10]通过MtDNA对长脂拟鲿和乌苏里拟鲿(Pseudobagmsussuriensis)进行了分类学上的比较分析；而基于MtDNA的长脂拟鲿种群遗传多样性研究未见报道。为此，笔者对长江水系沅江上游、珠江水系西江各30尾长脂拟鲿MtDNACytb基因序列进行扩增和测序，分析该种群Cytb基因序列的变异及遗传多样性，以期为其保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 长脂拟鲿

长脂拟鲿样品分别于2014年5月和10月采自长江水系沅江上游支流的氵舞阳河和珠江水系西江的漓江，各随机采集30尾活鱼进行解剖，取背部肌肉3～5 g用无水酒精保存，带回实验室于-20℃冰箱保存备用。

1.2 总DNA的提取

每尾长脂拟鲿取肌肉样品约30 mg，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总DNA。

1.3 PCR扩增及测序

参照文献[11]设计Cytb基因特异性引物，L14724：5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，H15915：5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’，引物由上海生物工程股份有限公司合成。PCR扩增反应总体系为30 μL，其中，2×Master Mix 15 μL、上下引物各2.4 μL、ddH2O 7.2 μL 和模板3 μL。Cytb基因PCR扩增条件为94℃预变性5 min；94℃变性45 s，61℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA纯化试剂盒纯化目的片段，并将目的片段送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。

1.4 数据处理

采用SeqMan、Clustalx(2.0)和MEGA(5.05)软件对所测序列进行对比排列，校准DNA序列的一致性。用MEGA(5.05)分子进化遗传分析软件计算碱基组成、核苷酸差异、序列差异。采用DNASP(5.10)计算遗传多样性参数。

从GenBank中下载细体拟鲿(Pseudobagruspratti) 的同源序列(GenBank 登录号:AY912410.1) 并以其作为外群，根据Kimura双参数法计算氵舞阳河种群、漓江种群单倍型间的遗传距离，并构建长脂拟鲿单倍型的UPGMA分子系统树。

2 结果与分析

2.1Cytb基因的PCR扩增

从图1看出，长脂拟鲿Cytb基因PCR 扩增的目的DNA 片段长度约1 200 bp，条带单一、清晰、明亮，未发现非特异性条带，空白对照未出现扩增产物，表明无外源DNA干扰，可用于后续试验。

注：M为DNA 分子量标准，泳道1～22为长脂拟鲿样品，对照为空白。

2.2 基因序列变异和氨基酸变异

对照乌苏里拟鲿Cytb基因的核苷酸全序列及其编码的氨基酸全序列(GenBank登录号:NC 020344.1)，去掉长脂拟鲿Cytb基因的核苷酸序列中测序反应信号不稳定的前端24个碱基、末端18个碱基的序列，得到长脂拟鲿种群长度为1 096 bp 的Cytb基因序列及其编码365个氨基酸的序列。

2.2.1Cytb基因序列变异 氵舞阳河种群Cytb基因序列中碱基A、T、C、G 的平均含量分别为27.9%、30.3%、27.2%和14.6%(表1)，A+T的含量高于G+C。漓江种群碱基A、T、C、G 的平均含量分别为28.3%、30.2%、27.2%、14.3%，A+T的含量高于G+C。

在长脂拟鲿Cytb基因中，3位密码子碱基的使用频率存在较大差异(表1)，在密码子第1位上，各碱基的使用频率接近；在密码子第2位上，以碱基T的使用频率最高，碱基G最低；在密码子第3位上，以碱基A的使用频率最高，碱基G最低。

表1 长脂拟鲿种群Cyt b基因密码子的核苷酸碱基组成

表2 长脂拟鲿种群Cyt b基因单倍型及序列变异位点

在氵舞阳河种群30尾长脂拟鲿Cytb基因序列中共发现6个变异位点(表2)，分别为171、552、642、748、768和1 063，变异位点数占总位点数的0.55%。其中，简约信息位点2个，位置为171和1 063；单变异位点4个，包括552、642、748和768。转换位点4个，包括A-G转换位点171和1 063，T-C转换位点642和768；颠换位点2个，包括A-C颠换位点552和G-T颠换位点748。转换与颠换位点数比(TS/TV)为2∶1。

在漓江种群30尾长脂拟鲿Cytb基因序列中共发现40个变异位点(表2)，变异位点数占总位点数的3.65%。其中，简约信息位点36个，单变异位点4个；转换位点33个，颠换位点7个。转换与颠换位点数比(TS/TV)为33∶7。

2.2.2Cytb基因氨基酸变异 在长脂拟鲿Cytb基因序列编码365个氨基酸组成的序列中，氵舞阳河种群共有2个氨基酸发生变化，分别是第250位丙氨酸Ala(GCU)变成丝氨酸Ser(UCU)、第355位缬氨酸Val(GUC)变为异亮氨酸Ile(AUC)。漓江种群有3个氨基酸发生变化，分别是第30位异亮氨酸Ile(AUU)变为亮氨酸Leu(CUU)、37位缬氨酸Val(GUA)变为异亮氨酸Ile(AUA)和355位异亮氨酸Ile(AUC)变为缬氨酸Val(GUC)。

结合核苷酸序列和氨基酸序列分析表明，氵舞阳河种群748(G-T)、1063(A-G)和漓江种群88(A-C)、109(G-A)、1063(A-G)改变的碱基位于密码子第1位上，使氨基酸种类发生改变，属于非同义突变；氵舞阳河种群的其他4个变异位点和漓江种群的其他37个位点，没有改变氨基酸种类，属于同义突变。

2.3 遗传多样性

氵舞阳河种群、漓江种群分别有6个和40个变异位点，分属6个和4个单倍型(表2)，单倍型多样性指数(Hd)分别为0.639和0.251，单倍型间平均遗传距离(P)分别为0.002 0和0.024 3，核苷酸多样性(Pi)分别为0.000 80和0.006 31。漓江种群和氵舞阳河种群Cytb基因序列共定义了10种单倍型，Hd为0.727，P为0.030 0，Pi为0.026 03。2个种群间的遗传分化指数(Fst)为0.817，基因交流值(Nm)为0.06。

从图2看出，10个单倍型分为2个分支，其中一个分支包括6个单倍型，代表30个个体，均为氵舞阳河个体；另一分支有4个单倍型，代表30个个体，均为漓江个体。

注：节点处数字为Bootstrap值，重复次数为1 000次。

3 结论与讨论

3.1 长脂拟鲿Cytb基因的碱基组成特征

长脂拟鲿氵舞阳河种群和漓江种群Cytb基因序列中A+T均高于 C+G，与刘焕章[12]关于鱼类MtDNA的研究结果相似，符合脊椎动物MtDNA碱基组成的特点[9]。Martin A P等[13]对鲨鱼(Sharks)线粒体DNA研究表明，在Cytb基因密码子不同部位存在明显的核苷酸差异，在密码子第1位，4种核苷酸的比例几乎相同；在密码子第2位，G的频率最低(12.8%～13.9%)；在密码子第3位，也以G的频率最低(1.0%～5.0%)。与长脂拟鲿氵舞阳河种群和漓江种群Cytb基因密码子碱基频率一致。长脂拟鲿Cytb基因密码子第2、第3位碱基频率的差异，可能源于2个位点受到的自然选择压力较小[14]；其差异性表明，线粒体基因组核苷酸组成具有不均一性，与Meyer A[14]的研究结论一致。

长脂拟鲿氵舞阳河种群和漓江种群Cytb基因序列发生转换与颠换位点数的比值(TS/TV)分别为2∶1和33∶7；转换位点数多于颠换，符合在线粒体基因组DNA 进化过程中通常发生转换频率高于颠换的规律。

3.2 长脂拟鲿Cytb基因密码子的变异

在长脂拟鲿漓江种群和氵舞阳河种群Cytb基因序列中，同义突变位点均多于非同义突变位点。Meyer A[14]认为， 密码子第3位点由于很少导致氨基酸替代(同义替代)，其突变的积累比导致氨基酸替代的突变(非同义替代)快得多，而且在突变中，密码子第3位点上的转换最为常见，其次是密码子第3位点上的颠换及密码子第1位点上的转换。氵舞阳河、漓江种群分别有66.7%和77.5%核苷酸突变发生在密码子第3位上，密码子第1位点上的突变分别仅占33.3%和22.5%，均未检测到密码子第2位点的碱基变异，与Meyer A[14]的研究结果一致。

3.3 长脂拟鲿种群内的遗传多样性

核苷酸多样性(Pi)是衡量一个种群MtDNA 遗传变异程度的指标。由于Pi值考虑各种MtDNA 单倍型在种群中所占的比例，因此在反映一个种群MtDNA 的多态程度时比单纯的遗传距离平均值更精确[15]。当Pi值在0.001 5～0.004 7时，种群的遗传多样性较低[16]。长脂拟鲿氵舞阳河种群、漓江种群Cytb基因的核苷酸多样性(Pi)分别为0.000 80和0.006 31，表明，长脂拟鲿氵舞阳河种群的遗传多样性较低，而漓江种群遗传多样性相对较高。

长脂拟鲿氵舞阳河种群的单倍型数和单倍型多样性指数(Hd)均高于漓江种群。氵舞阳河种群具有高单倍型多样性(0.639)、低核苷酸多样性(0.000 80)的特点，推测该群曾遭受过严重的瓶颈效应，说明长脂拟鲿氵舞阳河种群原先是由一个相对较小的有效种群迅速增长而来，通过变异积累了单倍型多态性，但却还没能来得及积累核苷酸多样性[17]。漓江种群核苷酸多样性虽然较高，但其单倍型数和单倍型多样性均低于氵舞阳河种群，其原因可能是由于长脂拟鲿漓江种群的数量急剧减少导致基因丢失，进而使其单倍型数减少。

3.4 长脂拟鲿种群间的遗传差异

氵舞阳河种群和漓江种群共60尾长脂拟鲿MtDNACytb基因的核苷酸多样性(Pi)为0.026 03，远远大于小口白甲鱼都柳江种群(0.004 7)[16]，表明氵舞阳河种群和漓江种群间的遗传多样性较高。2个种群内的核苷酸多样性(Pi)远远小于核苷酸多样性(Pi)；系统树中氵舞阳河种群的6个单倍型聚为一支，漓江种群的4个单倍型聚为另一支，表明2个种群间存在一定程度的分化。

遗传分化指数(Fst)表示2 个种群间的遗传分化程度，数值在0 ～1，Fst越大，表明2个种群的分化程度越高。基因交流值(Nm)表示种群间的基因交流程度，Nm>1表明2个种群间有基因交流，Nm<1 则可能预示着隔离的产生[18]。长脂拟鲿氵舞阳河和漓江种群间具有较大的Fst(0.817)和较小的Nm(0.06)，表明2个种群间有一定程度的遗传分化，几乎没有基因交流。

鱼类在属、种和种群三级水平上的遗传距离(P)值分别为0.9、0.30和0.05[16]。长脂拟鲿氵舞阳河种群和漓江种群间Cytb基因序列单倍型间的平均遗传距离(P)为0.030 0，小于0.05，表明2个种群间分化尚未达到种群水平。

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(责任编辑： 冯 卫)

Sequence Variation and Genetic Diversity ofCytbGene in the Population ofPseudobagrusadiposalis

DONG Po， DAI Yinggui*， YIN Bangyi

(CollegeofAnimalSciences，GuizhouUniversity，Guiyang,Guizhou550025,China)

To supply a scientific basis for the resource protection and utilization ofP.adiposalis, according to 30 individuals of the species collected from Wuyang River which is a tributary of the upper Yuanjiang River (located in the Yangtze River system) and 30 ones from the Lijiang River belonging to the Xijiang River (located in the Pearl River system)，the sequence variation and genetic diversity ofCytbgene inP.adiposalispopulation were studied for the first time. Results: 1 096 bp ofCytbgene sequence in the species was obtained. A total of six and forty variable loci were detected respectively in Wuyang River and Lijiang River. Six and four haplotypes were respectively diagnosed，the haplotype diversity(Hd)was 0.639 and 0.251 respectively，the average genetic distance(P)between the haplotypes was respectively 0.002 0 and 0.024 3，and the nucleotide diversity(Pi)was 0.000 80 and 0.006 31 respectively. There were four synonymous mutations sites and two non-synonymous mutations sites in theCytbgene of the individuals from the Wuyang River,and 37 synonymous mutations sites and three non-synonymous mutations sites in theCytbgene of the specimen from the Lijiang River. According to the 60 individuals ofP.adiposalis,a total of 10 haplotypes were diagnosed，the haplotype diversity(Hd)was 0.727，the average genetic distance(P)between the haplotypes was 0.030 0,and the nucleotide diversity(Pi)was 0.026 03.Fstvalue andNmvalue between the two populations were 0.817 and 0.06 respectively. The population ofP.adiposalisfrom the Wuyang River showed some differentiation from that in the Lijiang River，but both still belonged to the same population.

Pseudobagrusadiposalis；Wuyang River；Lijiang River；Cytb；genetic diversity

2015-01-26； 2015-04-20修回

贵州省留学人员科技活动项目 [黔人项目资助合同(2013)10]

董 坡(1988-)，男，在读硕士，研究方向：水产动物遗传育种与种质资源学。E-mail: dopo4108@163.com

*通讯作者：代应贵(1968-)，男，教授，从事鱼类学、渔业资源与环境研究。E-mail: daiygui@163.com

1001-3601(2015)06-0321-0138-05

S917

A