大鼠心室肌细胞膜片钳技术研究生实验设计

范 茁, 吴振强(华南理工大学 生物科学与工程学院,广东 广州 510006)



大鼠心室肌细胞膜片钳技术研究生实验设计

范 茁, 吴振强
(华南理工大学 生物科学与工程学院,广东 广州 510006)

面向生物学科硕士研究生开设细胞电生理实验可弥补高校细胞电生理实验教学领域的空缺，使学生更好掌握细胞电生理理论知识。论文详细阐述了依托于膜片钳实验技术、以大鼠心室肌细胞动作电位为主要研究对象的细胞电生理实验课程的具体实验内容，相关的实验方法和实验结果。记录大鼠心室肌细胞的动作电位、三种主要成分(Na+、K+和Ca2+)离子电流的分离可以使学生更好理解动作电位产生的离子机制和三种主要成分电流的动力学特性。此外，记录和观察BK单通道和全细胞电流特征可以使学生在认识某种特异性离子通道电流特性的同时加深对膜片钳实验技术的理解和掌握。

细胞电生理； 膜片钳； 动作电位； 全细胞电流； 单通道电流

0 引 言

高校各学科的教学强调理论和实践相结合，理论学习和科学实验相辅相成、互相促进从而提升教学的质量和效益。众所周知，实验能验证理论的正确性，能使抽象的理论知识更鲜明、易懂，能培养学生的创新能力，在高校各学科尤其是生物学科的教学体系中占有非常重要的地位[1-2]。然而，细胞电生理实验课，因为其技术难度高等客观原因一直是大多数高校生物教学领域的空白。本文将以大鼠心室肌细胞为主要研究对象，阐述本学校生物学院为研究生开设的细胞电生理实验课程的具体内容，包含课程涉及的具体的实验材料、方法、步骤以及对结果的分析。本课程涉及到的实验包括：大鼠心肌细胞动作电位和动作电流的观测；形成心肌细胞动作电位的主要成分离子电流(Na+、K+、Ca2+)的观测；转染于HEK293细胞上大电导钙激活钾离子通道(BK)单通道及全细胞电流的观测。

1 实验的选择依据

心肌细胞是除神经细胞、骨骼肌细胞外的另一大类重要的可兴奋性细胞，心肌细胞电生理是心肌搏动、泵血等生理功能的基础，对其研究有助于理解心肌兴奋收缩偶联、心跳等组织和机体电生理现象[3-5]。大鼠心室肌细胞动作电位时程较长，钙离子通道含量相对丰富，动作电位有明显的平台期，这些特性使之有利于用来研究不同相期和离子电流成分的对应关系[6-7]。此外，选择大鼠心室肌细胞作为细胞电生理实验课程主要研究对象是跟本实验室的科研方向相关的，我们有稳定可靠的样品来源能保障实验课的顺利进行。

本课程还包含对BK通道单通道及全细胞电流的观测，是为了让学生学习某种特异性的离子通道的电生理特性及其动力学特征。采取单通道和全细胞两种记录方法可以让学生掌握膜片钳技术中两种最普遍的记录方式，为其以后从事此领域的研究打下基础。BK是根据本实验室现有的离子通道质粒选择的，也可以选其他种类的离子通道。

2 实验材料和方法

2.1 大鼠心肌细胞的急性分离

体重为250～300 g的大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液麻醉，之后打开胸腔并迅速取下心脏，放入预冷的tyrode溶液中，轻轻挤压心脏后迅速将其挂在langendorff灌流装置上，无钙tyrode液灌流4 min，之后用含0.05 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型胶原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液灌流消化1 min，再用含 0.2 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型胶原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液灌流15 min，心脏变软后停止消化。将心脏取下，分离心室将其在含0.6 mmol/L Ca2+、1 mg/mL II型胶原酶和0.1 mg/mL蛋白酶的tyrode液中剪碎，37 ℃、50 r/min振荡消化4 min。之后用250 μm网筛过滤，500 r/min离心45 s，加入适量含1 mmol/L Ca2+的tyrode液重力沉降6～8 min。弃上清，加入适量KB液于4 ℃保存[8-12]。

2.2 细胞培养及BK通道的转染

HEK293细胞隔天传代，放置于含5% CO2的培养箱37 ℃恒温培养，隔天用胰酶消化并传代于底部铺有碎玻璃片的35 mm塑料平皿中。待玻片上的细胞密度达到80%左右，采用脂质体(Lipo 2000，GIBCO)转染法，将克隆有BK通道的质粒pcDNA3.1-BK和绿色荧光蛋白GFP共转染于HEK293细胞，24 h后选择发绿色荧光的细胞用于膜片钳实验。

2.3 电生理记录

膜片钳记录使用的是HEKA公司的EPC-10型号放大器(HEKA，德国)，实验在室温(≈22 ℃)进行。玻璃电极由Sutter公司的P97电极拉制仪(Sutter，美国)拉制而成，用于全细胞记录的电极电阻为2～4 MΩ，用于单通道记录的电极电阻为4～6 MΩ。全细胞记录的采样频率为2 kHz，单通道记录的采样频率为10 kHz。心室肌细胞动作电位由900 pA、5 ms的脉冲电流诱发，动作电流则反过来以测得的动作电位为刺激电压程序。心室肌细胞三种成分离子电流(Na+、K+和Ca2+)的分离，则通过阻断剂和不同的电压脉冲程序实现。Na+电流通过1 uM TTX和时长为1 s的-40 mV钳制电压阻断失活，K+电流通过TEA+和Cs+阻断，Ca2+通道通过10 μmol/L nifedipine阻断[13-15]。三种离子电流记录的电压脉冲程序分别为：Na+，-90～-10 mV;K+,-90～+30 mV;Ca2+,-40～+60 mV;三种离子混合电流，-90～+30 mV。

2.4 溶液和试剂

实验中用到的所有配置细胞内外液的试剂和药品均购自Sigma公司(Sigma Aldrich，美国)，各溶液配方如下。

Tyrode液(in mmol/L)：120 NaCl，5.4 KCl，25 HEPES，5 MgCl2，0.33 NaH2PO4，22 Glucose，10 Taurine(pH 7.2～7.4)。

KB液(in mmol/L):80 KOH,40 KCl,25 NaH2PO4,3 MgSO4, 50 L-glutanic acid,20 Taurine,1 EGTA,10 HEPES, 10 Glucose(pH 7.2～7.4)。

膜片钳记录细胞内外液。

Solution外(in mmol/L): 1.3 CaCl2, 0.8 MgSO4, 5.4 KCl, 0.4 KH2PO4, 136.9 NaCl, 0.3 Na2HPO4, 10 D-glucose and 4.2 NaHCO3(pH 7.2～7.4)。

Solution内(in mmol/L): 140 KCl, 5 ATP-Mg, 10 EGTA, 10 HEPES(pH 7.2)。

记录钙离子电流的细胞内液。

Solution内Ca2+(in mmol/L): 110 CsCl,5 ATP-Mg,10 EGTA,10 HEPES,30 TEA-Cl(pH 7.2)。

3 实验结果

3.1 大鼠心室肌细胞动作电位和动作电流

图1是在电流钳模式下测得的大鼠心室肌细胞动作电位，以及在动作电位钳下得到的对应于动作电位的动作电流。在实验课上主要让学生记录细胞的静息电位；观察动作电位的形态，结合动作电流分析动作电位形成的原因；计算动作电位的时程。

3.2 大鼠心室肌细胞Na+、K+和Ca2+三种成分离子电流的分离

用nifedipine阻断钙通道，-90～-10 mV梯度变化的脉冲程序可以记录到Na+通道的电流(图2B)；外液中加TTX并用1 s、-40 mV的钳制电压阻断失活Na+通道，-90～+30 mV的程序分离K+通道电流(图2(c))；用钙通道内液(见材料和方法2.4)并用TTX阻断Na+通道，-40～+60 mV的电压程序记录Ca2+通道的电流(图2(d))，用正常内外液，-90～+30 mV的电压可以记录到全部成分的离子通道电流(图2(a))。通过本实验，学生分离出和动作电位相关的三种主要成分的离子电流，通过观察其激活速率、时程和流向加深对动作电位形成的离子机制的理解，实验中及实验后要让学生注意观察并分析三种不同成分离子电流的动力学特征。

图1 大鼠心肌细胞动作电位和动作电流

(a) 电流钳模式，给予大鼠心肌细胞900 pA，5 ms的电流刺激所得到的动作电位；(b) 电压钳模式下，以动作电位作为钳制电压程序得到心肌细胞的动作电流

图2 大鼠心肌细胞不同成分的离子电流

3.3 BK通道的单通道及全细胞电流记录

BK单通道采用cell-attach模式记录，钳制电位-110 mV，破膜后记录BK全细胞电流，电压脉冲程序-90～+50 mV[16]。图3为转染到HEK293细胞上的BK单通道及全细胞电流。实验中让学生观察并记录BK单通道和全细胞电流的幅度。通过本实验可以使学生认识某种特定种类的离子通道亚型单通道及全细胞的电流特征。此外，通过单通道和全细胞记录模式的练习，可以使学生加深对膜片钳两种7最基本和应用最广泛的记录方法的认识和理解。

4 结 语

本文详细阐述了为研究生开设的膜片钳实验技术课程所涉及的具体实验内容、方法和结果，以及实验的选择依据。我们选择用大鼠心肌细胞为样品研究动作电位和不同成分离子电流，是和本研究室的研究方向一致的，以神经电生理为研究方向的实验室也可以选择以神经元细胞为研究对象。除此之外，研究某种特异性离子通道的单通道和全细胞电流也可以选择BK之外的任何一种通道。总之作为实验教学课程，要以实验操作方便和简单，实验结果清晰明了为原则。实验课程以大鼠心肌细胞为研究对象，观测其动作电位和与之对应的动作电流，进一步通过阻断剂和钳制电压相结合的方法分离出三种主要成分的离子电流，可以使学生更好地理解动作电位产生的离子机制。在同一个细胞记录同一种离子通道的单通道和全细胞电流，可以使学生学习某种特异性离子通道的电流特性，掌握膜片钳两种应用最广的记录模式，加深对膜片钳技术的认识和理解。总之我们通过为生物学科研究生开设膜片钳电生理实验课程，希望可以弥补学科在细胞电生理实验课程方面的不足，增强学生对细胞电生理理论知识的理解，扩展其知识面，提高其动手能力和创新能力。

(a) BK单通道电流

(b) BK全细胞电流

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Design of Patch Clamp Technique Course on Rat Ventricular Myocytes for Postgraduates

FANZhuo,WUZhen-qiang
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The experimental courses of cell electrophysiology for biological graduate students can fill the gaps in the field of cell electrophysiological experiments, and enable students to better grasp the theoretical knowledge of cell electrophysiology. This paper describes the detailed contents of the experimental courses relying on patch clamp technique and the related experimental methods and results. Recording action potential of rat ventricular myocytes and identifying the three major ion channel components (Na+, K+and Ca2+) allow students to better understand the mechanism of action potential and the dynamic properties of the three main types of ion channel currents. In addition, observation and recording the properties of BK single-channel and whole-cell current allows students to know the characteristics of a specific kind of ion channel and also to deepen their understanding and mastering in patch-clamping experimental technique.

cell electrophysiology; patch clamp; action potential; whole-cell current; single-channel current

2014-04-03

华南理工大学研究生重点课程建设项目(yjzk2011011)

范 茁(1979-)，女，河北定州人，博士，实验师，研究方向：细胞电生理。Tel.：13560407718; E-mail:fanzhuo@scut.edu.cn

Q 291；G 642.3

A

1006-7167(2015)02-0206-03