降糖1号水提部分提取工艺研究

★　宋会珠第一作者：宋会珠(99—)，女，硕士研究生。研究方向：中药及天然药物的研究与开发。　钱丽梅　张建芬　李越兰通信作者：李越兰(956—)，女，硕士生导师。研究方向：中药复方药效物质基础。E-mail：yuelanli@63.com。　(.浙江中医药大学药学院　杭州 30053；.浙江树人大学生物与环境工程学院　杭州 3005)

降糖1号水提部分提取工艺研究

★宋会珠1*第一作者：宋会珠(1991—)，女，硕士研究生。研究方向：中药及天然药物的研究与开发。钱丽梅1张建芬2李越兰1*通信作者：李越兰(1956—)，女，硕士生导师。研究方向：中药复方药效物质基础。E-mail：yuelanli@163.com。(1.浙江中医药大学药学院杭州 310053；2.浙江树人大学生物与环境工程学院杭州 310015)

摘要：目的：优选降糖1号中黄芪、地骨皮等水提部分药材的提取工艺条件。方法：建立水提液中黄芪甲苷的RP-HPLC-ELSD含量测定方法。采用正交试验法，以黄芪甲苷得率为指标，考察加水量、提取时间、提取次数对黄芪甲苷得率的影响，优选水提部分药材的提取工艺条件。结果：水提取部分的最优工艺条件为：12倍量水提取3次，每次1h。结论：优选得到的工艺条件，设计合理，稳定可控，有效成分得率较高。

关键词：提取工艺;黄芪;黄芪甲苷;RP-HPLC-ELSD

降糖1号是临床经验方，由地骨皮、黄芪、女贞子、关黄柏等七味中药组成。具有明显的降低糖尿病患者血糖水平，改善糖尿病并发症等作用。为了将其开发成治疗糖尿病的中药新药，更有效的发挥其临床应用，根据处方中各药味的理化性质，将其分为水提部分及醇提部分。课题组已优选了关黄柏、女贞子醇提的工艺条件[1]。本项目对其水提部分的工艺条件进行了研究，以期为降糖1号的新药开发研究提供科学依据。地骨皮水提物具有明显的降血糖作用[2]，黄芪水提物及黄芪中的三萜皂苷类物质亦具有明显的降血糖作用[3]。故本研究以水为溶媒，对地骨皮、黄芪等五味药材进行了提取，采用正交试验，以黄芪甲苷的得率为指标优选水提部分的工艺条件。

1仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪(1525二元分析泵、717自动进样器、2420蒸发光散射检测器)；旋转蒸发仪(BUCHI Labortechnik,Sweden)；电子天平(Mettler Toledo,AB 104-N)。

地骨皮、黄芪均购自华东医药股份有限公司，地骨皮产地为陕西；黄芪产地为甘肃。黄芪甲苷对照品(批号：0781-200210)购自中国药品生物制品检定所。高效液相分析用乙腈为色谱纯，水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1黄芪甲苷含量测定方法[3-4]

2.1.1色谱条件Waters高效液相色谱仪：1525二元分析泵、717自动进样器、2420蒸发光散射检测器(ELSD)，Empower色谱工作站；Agilent C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-水38∶62，柱温为25℃，流速：1.0mL/min；2420参数设置：Gain：135，漂移管温度(drift)55℃，载气压力25 psi。

2.1.2黄芪甲苷对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品约0.01g，精密称定，定容于10mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得黄芪甲苷对照品溶液的母液，精密移取3mL黄芪甲苷母液于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成约300μg/mL的黄芪甲苷对照品溶液，即得。

2.1.3水提部分样品的制备准确称取一个处方量的水提部分的药材，采用回流提取法，按照L9(34)正交表安排试验。提取液过滤，浓缩定容至100 mL的容量瓶中，即得。

2.1.4样品供试液的制备精密移取各试验项下的水提样品10 mL，加水饱和正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并三次正丁醇萃取液，以氨试液洗涤2次，每次20 mL。弃去氨水层，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解，转移定容至5 mL的棕色量瓶中，过0.45 μm的微孔滤膜，即得。

参考文献2.2水提部分因素水平的确定以及预试验结果，确定考查加水量、提取时间、提取次数，三个与黄芪甲苷得率密切相关的因素，并确定了各因素的水平，见表1。

表1　黄芪、地骨皮等五味水提中药正交试验因素水平表

2.3水提液中黄芪甲苷含量测定方法的建立

2.3.1专属性试验除黄芪外准确称取一个处方量的水提部分的药材，按照水提样品的制备方法制备阴性样品供试液；另取7号正交试验的水提样品，照样品供试液制备方法制备样品供试液；另取黄芪甲苷对照品(308μg/mL)；以上三种供试液各取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示。从图谱得知，阴性样品中黄芪甲苷相应的位置无色谱峰(B)，7号样品供试液(C)在与对照品(A)保留时间相同处出色谱峰，表明水提部分中其他药材对黄芪甲苷的含量测定无影响。

A.黄芪甲苷对照品溶液；B.阴性样品；C.样品供试液

2.3.2线性关系的考察分别精密量取1.0 mg/mL的黄芪甲苷母液0.1,0.2,0.5,0.6,0.8 mL于1 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成浓度为100,200,500,600,800μg/mL的黄芪甲苷对照品溶液，吸取20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(单位：μg)的对数为横坐标，以峰面积的对数为纵坐标进行线性回归，回归方程为：Y=1.372 4X+2.791 3，r=0.999 9，表明黄芪甲苷在进样量2～16μg之间有良好的线性关系。

2.3.3精密度考察精密吸取308μg/mL的黄芪甲苷对照品溶液10μL,连续重复进样6次，记录峰面积，RSD为0.2%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性试验取6号正交试验水提样品，按前述方法制备样品供试液，精密吸取10μL样品供试液分别于0,3，6，9，12h进样，记录峰面积，峰面积在12h内RSD为0.57%，表明黄芪甲苷样品供试液在12h内稳定。

2.3.5重现性试验取7号正交试验水提样品，按前述方法制备样品供试液，平行制备5份供试液，精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积；另取10，20μL的黄芪甲苷对照品溶液(308μg/mL)注入高效液相色谱仪，记录峰面积，利用对数外标两点法定量，黄芪甲苷浓度的RSD为1.33%(n=5)，表明重现性良好。

2.3.6回收率试验称取一个处方量的水提部分药材，加6倍量水提取2次，每次1.5h，合并提取液，浓缩定容至100mL的容量瓶中，按前述方法制备样品供试液，并用上述方法测得黄芪甲苷含量为0.109 9mg/mL。精密移取上述已知含量的水提液10mL，精密加入浓度为1.0 mg/mL的黄芪甲苷1.00 mL，按样品供试液项下的方法制备样品，平行制备6份样品，测定其中黄芪甲苷的含量，计算回收率，结果平均回收率为99.4%，RSD为2.0%(n=6)，表明该方法回收率良好。

2.4水提部分黄芪甲苷的含量测定精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(308μg/mL)10μL和20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积；精密吸取各试验项下的样品供试液各10μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积。利用对数外标两点法定量，计算黄芪甲苷的含量，结果见表2。对正交试验结果进行了方差分析，结果见表3。

表2　黄芪、地骨皮水提正交试验结果

表3　方差分析表

查表：F0.1(2,2)=9.00,F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。

方差分析结果表明，加水量和提取次数对黄芪甲苷得率的影响具有显著性差异，提取时间对黄芪甲苷提取得率影响不大；各因素对黄芪甲苷得率影响的大小顺序为C>A>B。故提取次数选3水平，即：提取3次；加水量选3水平，即：加12倍量的水；提取时间对黄芪甲苷得率的影响不大，从生产实际出发选1水平，即：提取1h。因此，水提工艺的最佳条件应为A3B1C3，即加12倍量的水提取3次，每次1h。据此条件验证三批，结果见表4。验证试验结果与正交试验结果基本一致。据此确定黄芪、地骨皮等五味中药的水提工艺条件为A3B1C3，即12倍量水提取3次，每次1h。

表4　黄芪、地骨皮水提正交验证试验结果

3讨论

3.1黄芪甲苷的含量测定方法黄芪甲苷为三萜皂苷类物质，在紫外区仅有末端吸收，溶剂会影响其定量的准确度，故2005、2010年版药典都采用蒸发光散射检测器对其进行含量测定[4-5]。本研究表明：蒸发光散射检测器对复方水提液中的黄芪甲苷的检出具有灵敏度高、线性范围宽、定量准确等优点。

3.2样品供试液的制备黄芪甲苷样品供试液制备过程中，正丁醇的用量，萃取的次数，氨水洗涤条件，均能影响到黄芪甲苷的含量及色谱峰的峰形，通过试验确定加水饱和正丁醇萃取3次，每次30mL，氨试液洗涤2次，每次20mL，能有效地将黄芪甲苷从水提液中溶出，且能保证其色谱峰峰形及与其它组分具有良好的分离度。

3.3水提工艺条件正交试验方差分析结果表明：提取次数、加水量对黄芪甲苷的溶出均具有显著性差异，故这两个因素均选择3水平。用优选得到的工艺条件制备三批样品，验证试验结果与正交试验结果一致，故优选得到的降糖1号水提部分工艺条件稳定、可靠，能为降糖颗粒的开发提供科学依据。

[1]张建芬，陈尉青，蒋新龙.降糖1号关黄柏部分的提取工艺研究[J].中成药，2010，32(10):1 826-1 828.

[2]李康，毕开顺，司保国.地骨皮中不同组分对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用[J].中医药学刊，2005，23(7):1 298-1 299.

[3]谢春英.黄芪甲苷降血糖作用的实验研究[J].中药材，2010，33(8)：1 319-1 320.

[4]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京：化学工业出版社，2005:212-214.

[5]国家药典委员会.中国药典·一部[S].北京：化学工业出版社，2010:283-285.

Water Fraction Extraction Process of Hypoglycemic No.1

SONG Hui-zhu1，QIAN Li-mei1，ZHANG Jian-fen2，LI Yue-lan1

1.CollegeofPharmacy,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053，China;

2.CollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ZhejiangShurenUniversity,Hangzhou310015，China

Abstract:Objective: To optimize extraction process conditions of Astragalus membranaceus, cortex lycii radicis and other water extraction medicinal herbs in hypoglycemic No. 1. Methods: To establish a RP-HPLC-ELSD method for determination of astragaloside A in water extraction. The astragaloside A extraction rate was selected as index, using orthogonal test method, the influence of amount of water, extraction time, extraction times on the yield of astragaloside A was investigated, to optimize extraction process conditions of water extraction medicinal materials. Results: The optimum process conditions of water extraction was as follows: 12 times of water and extracting for 3 times, each time is 1 hour. Conclusion: The optimized process conditions is reasonable, stable and controllable, the yield of effective components is high.

Key words:Extraction Process; Astragalus Membranaceus; Astragaloside A; RP-HPLC-ELSD

收稿日期：(2014-10-23)编辑：曾文雪

中图分类号：R284.2

文献标识码：A