中心组合设计及响应曲面法优化炒栀子中试工艺*

中心组合设计及响应曲面法优化炒栀子中试工艺*

★马志林*第一作者: 马志林(1982—)，男，硕士。研究方向：中药分析。梅玲华*通信作者: 梅玲华(1962—)，女，执业中药师。Tel：021-50272965，E-mail：jackey5460@163.com。沈丽琴杜育华胡浩武(江西汇仁药业有限公司南昌 330004)

摘要：目的：优化炒栀子的中试工艺，考察炒栀子中试炮制工艺过程中栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量变化。方法：分别对炮制工艺参数炒制时间、炒制温度、药机转速、投料量因素进行单因素考察，以栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量为评价指标，采用中心组合设计及响应曲面法结果分析进行评价，通过数据模拟及验证方法对栀子饮片中试工艺进行工艺确认。结果：根据分析得到最优中试炮制工艺条件为：炒制温度为184.6℃，炒制时间15 min，药机转速20r/min，该药机单次最佳投料20kg；栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II含量的预测值分别为40.36，6.26、0.80mg/g，本研究预测值通过中试放大生产得到了良好的验证，且在炮制品色泽方面均符合药典规定要求。结论：本研究优化结果为栀子饮片炮制中试工艺提供指导性实验依据。

关键词：中心组合设计；响应曲面法；炒栀子；炮制工艺；栀子苷

栀子性苦、寒，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效[1]。为适应中医临床辨证的需求，栀子常以其炮制品入药，其炮制方法有多种，现代主要沿用生品、炒黄、炒焦、炒炭、姜汁炙等。《中国药典》2010年版一部中收载的栀子加工方法有生栀子、炒栀子、焦栀子，其中炒栀子在临床应用中最为广泛，2010年版《中国药典》仅规定了其炒制的色泽及栀子苷含量，其中试炮制工艺参数无明确规定。本实验主要对在中试工艺过程中炮制参数，如炒制时间、炒制温度、药机转速、投料量因素进行单因素主次影响比较，以栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量分别为评价指标，采用中心组合设计及响应曲面法对炒栀子炮制工艺进行优化，并考察炮制过程中炒制过程中随着各因素的变化分别对栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量影响。

1材料

Agilent 1100系列高效液相色谱仪(安捷伦科技公司)，色谱柱YMC-Pack ODS-AQ(150mm×6.0mm,5μm，YMC公司)，CP225 D型1/10万电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，YF-113型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市环球药械厂)，CY800-III型滚筒式炒药机(常熟倍诚中药机械厂)，ST-20 Raytek Raynger型红外测温枪(美国雷泰公司)。

栀子采自樟树栀子种植基地，经江西中医学院罗光明教授鉴定为茜草科植物栀子Gardeniaja.sminnde.sEllis的干燥成熟果实。栀子苷(中国食品药品检定研究院，批号110749-200714)、西红花苷-I、西红花苷-II对照品(均购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号分别为MUST-11071108、MUST-11091002)，甲醇、乙睛为色谱纯，水为双蒸水(自制)，其他试剂均为分析纯。

2方法和结果

2.1栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量测定

2.1.1色谱条件色谱柱YMC-Pack ODS-AQ(150mm×6.0mm,5μm,YMC公司)，流动相：甲醇(A)-水溶液(B)，梯度洗脱(0→15 min，A为20%；15→20 min，A 为20%→48%；20→50 min，A 为48%)；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：0～24min为238nm，24～45min为440nm；进样量：l0μL。按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各l0μL，注入液相色谱仪。结果表明，栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的谱峰分离良好。色谱见图1

A 混合对照品；B供试品；1-栀子苷，

2.1.2对照品制备分别精密称取栀子苷对照品与西红花苷-I、西红花苷-II标准品适量，加甲醇制成每1mL栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II分别约含220.0, 13.0，3.0μg的混合溶液，即得。

2.1.3供试品制备取栀子药材粉末(过4号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀滤过。精密量取续滤液10mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.4线性关系考察精密吸取混合对照品溶液2，5，10，15，20，25μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II色谱峰峰面积积分值，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，进行线性回归，得3种成分的回归方程、相关系数与线性范围，见表1。

2.1.5稳定性试验取“2.1.3”项下供试品溶液，按上述色谱条件分别于0,2,4,6,8,12,24 h注入液相色谱仪，进样10μL。结果，栀子苷的峰面积RSD=0.49%(n=6)；西红花苷-I的峰面积RSD=0.76% (n=6)，西红花苷-II的峰面积RSD=0.92 % (n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

表1　线性回归方程、相关系数及线性范围

2.1.6精密度试验精密吸取“2.1.3”项下供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，连续重复进样6次。结果栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II的RSD分别为1.32 %，1.52 %，1.50 %(n=6)，表明本方法精密度较好。

2.1.7重复性试验取同一批样品，照“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按上述拟定的含量测定方法操作。结果，栀子苷的平均含量为45.66mg/g， RSD=1.61% (n=6);西红花苷-I的平均含量为7.792 mg/g，RSD=1.68%(n=6);西红花苷-II的平均含量为1.684mg/g ，RSD=1.23 % (n=6)，表明本方法重复性较好。

表2　加样回收率试验结果(n=6)

2.1.8加样回收率试验取已知含量样品(栀子苷 46.71mg/g，西红花苷-I 7.20mg/g，西红花苷-II 1.80mg/g)的样品共6份，精密称取0.1g，置具塞三角瓶中，分别精密加入栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II混合对照品甲醇溶液(栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II浓度分别为191.2μg/mL，26.78μg/mL，6.82μg/mL ，25mL，按供试品制备方法项下方法制备供试品溶液。吸取加样供试品溶液10μl注人液相色谱仪，按上述色谱条件测定栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II的含量，计算加样回收率，结果见表2。

2.2栀子炮制

2.2.1因素水平设计根据前期单因素实验研究可知，不同因素对栀子有效成分的含量影响程度不同，为了进一步优化炮制条件，本研究选择中心组合实验设计，分别对以上4个影响因素进行设计，选取的水平如表3所示。

表3　影响栀子中试炮制因素与水平

表4　中心组设计实验结果

各因素的组合即实验结果见表4所示，在实验设计中，每个实验点重复3次，结果取平均值，以炒制温度A、炒制时间B、炒药机转速C、中试投料量D，以栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II等指标作为响应值，利用Design-expert8.0.5软件对表中的实验结果进行回归分析，得到栀子苷二元多次方程模型。

以栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II含量为响应值，用Design Expert8.0.5统计软件中ANOVA项进行分析，表5显示栀子苷模型的P=0.001 1(P<0.05)，相关系数R2=0.817，表明该模型显著，精确度基本满足要求。而西红花苷-I和西红花苷-II模型的P值均大于0.05，模型不显著，结果分别见表6-7。在各项方差分析中，当P值小于0.05时表明影响显著，因此，在栀子苷含量中，A、B、C的一次项、B2对栀子苷含量影响显著，回归方程为：

Y1=33.12+3.18*A-2.57*B-3.41*C+1.76*A*B+1.57*A*C+0.91*B*C-2.42*A2+6.76*B2-0.61*C2

西红花苷-I含量中，AB、A2、B2对西红花苷-I含量影响显著，回归方程为：

Y2=4.52+0.18*A+0.022*B-0.23*C+0.61*A*B-0.34*A*C+0.10*B*C-0.91*A2+1.00*B2+0.23*C2

西红花苷-II含量中，各因素对其含量影响均不显著，回归方程为：

Y3=0.63-9.986E-003*A-0.058*B-0.035*C+0.065*A*B-0.058*A*C+1.240E-003*B* C-0.061*A2+0.051*B2+0.091*C2

A项的负系数表明它的改变带来响应值的降低，B、C项的正系数能够引起响应值的增高，二次项的负系数决定方程抛物面的开放，这说明它有一个极大值，故能实现优化分析。通过观察线性项和二次项系数，可以得出各因素对栀子苷含量的影响次序为：中试温度>中试炒制时间>中试转速>中试投料量。

2.2.2响应面法优选工艺条件 炒制温度和炒制时间、炒制温度和药机转速、炒制时间和药机转速对栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II含量的二阶回归模型的效应面图见图2-4。通过图中各因素对响应值的直观分析，可以对两因素间的相互作用分别进行分析。

图2　炒制温度和炒制时间对栀子苷、

由图2可知，炒制温度较低时，栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量分别随着温度的增加而增加，当温度超过一定值时，栀子苷含量反而随其增加而减小。栀子苷的含量随着炒制时间的增加而减少，当时间超过一定值时，它们的含量又随其增加而增加。由图可以看出，两因素的交互作用显著。

由图3可知，炒制温度较低时，栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量随着温度的增加而增加，当温度超过一定值时，栀子苷含量趋于平稳，而西红花苷-I、西红花苷-II的含量却随着温度的升高而降低。药机转速对栀子苷、西红花苷-I的含量的影响不大；而西红花苷-II的含量却随着药机转速增加而降低，当药机转速超过一定值时，其含量又随其升高。由图可以看出，两因素的交互作用显著。

图3　炒制温度和药机转速对栀子苷、

图4　炒制时间和药机转速对栀子苷、

由图4可知，炒制时间较短时，栀子苷、西红花苷-I的含量随着炒制时间的增加而降低，当炒制时间超过一定值时，栀子苷、西红花苷-I含量又随其增加而升高；而西红花苷-II的含量总体上是随着炒制时间的增加而升高。而药机转速对栀子苷、西红花苷-I的含量影响不大；反而对西红花苷-II的影响显著，总体上随着药机转速的增加西红花苷-II的含量增加。由图可以看出，两因素的交互作用不显著。

2.2.3栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II含量方差分析结果见表5-7。

2.2.4最优条件的确定根据上述实测结果以及方差分析结果表明：栀子饮片中试工艺的最佳条件为：炒制温度为184.6℃，炒制时间15min，药机转速20r/min，投料20kg。结合软件模拟预测得到了栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II含量预测值分别为40.36，6.26，0.80mg/g，表明实验方法相对可靠。因此，我们认为采用Box-Behnken的中心组合试验设计优化得到的栀子中试工艺条件准确可靠，具有实际指导意义。

2.2.5中试工艺放大验证为了对上述预测值进行合理性验证，我们基于上述建立的数学模型，确定得到最优条件：炒制温度为184.6℃，炒制时间15min，药机转速20r/min，投料20kg。然后，我们进行了进一步中试生产验证，放大生产的3批栀子饮片，以检验其炒制饮片工艺的可靠性，根据炒制参数要求，分别生产制备了1，5，8，10倍量的栀子饮片，即制备量分别为20，100，160，200kg的栀子炒制品。分别对这4批次栀子饮片进行了主要有效成分(栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II含量)进行检测，结果见下表8。

表5　栀子苷含量方差分析表

由表8结果表明，根据确定的工艺放大生产的3批样品，与中试样品测定结果相比较，在栀子主要有效成分含量结果方面，整体数据均比较接近，4组主要有效成分含量(栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II)的RSD值分别为：2.11%，1.26%，4.30%，RSD值均小于5%，说明在该工艺下放大制备栀子饮片相对稳定、可靠。由此我们认为，本研究工艺可以良好的应用于栀子饮片炮制大生产。

表6　西红花苷-I含量方差分析表

表7　西红花苷-II含量差分析表

注*：A代表炒制温度，B代表炒制时间，C代表药机转速。

注**：相互比较*P<0.05，**P<0.01。

表8　栀子饮片中试工艺放大验证结果(n=3)　　mg/g

3讨论

栀子中含有环烯醚萜类、有机酸类、黄酮类、色素类等成分，环烯醚萜类成分具有利胆作用, 其中含量最高的栀子苷还有一定的抗炎、解热和轻泻作用，色素类中的西红花苷具有祛黄、利胆及降血脂作用[2]，为栀子的主要有效成分。因此本试验选取栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II作为炮制工艺研究考察指标。

由于栀子苷的紫外最大吸收波长为238nm，西红花苷-I、西红花苷-II的最大吸收波长为440nm，所以本试验中含量测定采用波长切换技术对其进行含量测定，即0～24min为238nm，24～45min为440nm。

生栀子性味苦寒，长于清热泻火，凉血解毒，焦栀子苦寒之性缓和，且增强止血作用，功效凉血止血，多用于血热吐血，尿血崩漏。栀子药性变缓与其主要有效成分含量降低有关。本试验通过中心组合设计，考察炒制温度、炒制时间、药机转速对栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II含量影响。随着炒制温度的升高和炒制时间的延长，栀子中栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II含量均有下降，各因素对栀子苷含量的影响最显著。对栀子苷含量的影响次序为：中试温度>中试炒制时间>中试转速>中试投料量。赵淑杰等[3]研究发现栀子经炒黄、炒焦、炒炭后栀子苷含量降低率为分别为4.63%，6.06%，43.32%，与本试验结果相符。通过对试验结果的分析，确定了确定得到最优条件，并通过中试验证，表明该工艺稳定可行，为大批量生产工艺提供了研究依据。

参考文献

[1]张留记, 刘钦松, 屠万倩,等.Rp-HPLC色谱法同时测定不同产地栀子中栀子苷、西红花苷-I和西红花苷-II的含量[J].中国药房,1011,22(7):630-632.

[2]邓颖, 郭志刚, 曾兆麟.藏红花的药理研究进展[J].中国中药杂志, 2002, 27(8):565-568.

[3]赵淑杰，梁大雪.栀子及其炮制品中栀子苷的含量分析[J].中国中药杂志，1994，19(10)：601-602.

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(收稿日期：2014-12-30)编辑：曾文雪

*基金项目:国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAI04B01)。

中图分类号：R284.2

文献标识码：A