自体外周血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化

李梅 党双锁 田长印 翟嵩 贾晓黎 赵文学 张欣 潘国英 王媛 高宁

肝硬化失代偿期是多种慢性肝病的终末期状态，内科治疗效果差，病死率较高。目前，最为有效的治疗方法是原位肝移植，但因供肝严重缺乏、移植后排斥反应、高额的治疗费等因素严重限制了其临床应用。近年来随着干细胞的深入研究，干细胞移植治疗肝硬化的动物实验结果令人满意，有可能成为除肝移植外治疗肝硬化的有效手段。本研究对42例肝硬化失代偿期患者进行分组设计，平行对照观察评价自体外周血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的有效性及安全性。

资料和方法

一、一般资料

选择2012年4月至2014年2月于西安交通大学医学院第二附属医院住院治疗的42例失代偿期肝硬化患者，分为自体干细胞移植组和对照组。干细胞移植组20例，男女比例1.2∶1，年龄39～68岁(平均51.9岁)，其中乙肝肝硬化14例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例，其他原因所致肝硬化1例，Child-Pugh分级B级18例，C级2例。对照组22例，男女比例1.2∶1，年龄 38 ～70 岁(平均 52.5 岁)，其中乙肝肝硬化14例，丙肝肝硬化3例，酒精性肝硬化2例，自身免疫性肝炎肝硬化2例，其他原因所致肝硬化1例，Child-Pugh分级B级19例，C级3例。两组患者性别、年龄差异无统计学意义。所有患者住院期间，均予以内科对症支持治疗，包括保肝、利尿、限制水钠摄入等。治疗方案得到医院伦理委员会同意，且在患者及家属充分知情的情况下进行，签署知情同意书。

二、纳入标准

临床诊断均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》有关肝硬化的标准［1］。

排除上消化道出血、肝性脑病、原发性肝癌以及妊娠者。

三、自体外周血干细胞移植

(一)外周血干细胞(peripheral blood stem cell，PBSC)采集:予重组人粒细胞集落刺激因子(G-CGF，白特喜，山东科兴生物制品有限公司)300μg/d，皮下注射，连续3～4 d，进行PBSC动员。监测外周血白细胞计数及单核细胞计数，当外周血白细胞≥10.0×109/L，单核细胞≥1.0×109/L，满足采集条件。动员期间观察有无发热、骨痛、乏力、皮疹、胃肠道反应、自发性脾破裂、严重化脓性感染、高凝状态等。应用美国Spectra血细胞分离机采集PBSC悬液100 mL。采集过程中观察患者有无低钙性口周麻木、抽搐、迷走神经反应性面色苍白、低血容量性面色苍白、晕厥等不良反应。分离的PBSC 4℃保存，于4 h内行移植术。

(二)经肝动脉行自体PBSC肝脏移植术:术前6 h行碘过敏试验、双侧腹股沟备皮。经股动脉穿刺插管，置管于肝固有动脉进行造影，观察肝内血管情况并排除占位性病变。将干细胞悬液约100 mL经肝动脉缓慢注入;术毕拔管，穿刺点加压包扎后返回病房，穿刺侧下肢制动6 h，卧床24 h。

四、疗效观察

治疗后随访4、8、12、24周，观察临床症状变化(乏力、纳差、腹胀)，TBil、ALT、AST、Alb、凝血酶原时间(PT)、凝血酶原活动度(PTA)及Child评分。

五、统计学处理

用SPSS 19.0软件分析。计量资料以 均数±标准差表示，采用t检验和方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、术后患者一般情况

干细胞移植组20例患者中17例乏力、纳差症状减轻，15例腹胀减轻，3例患者自觉症状无明显改善。对照组22例患者中17例乏力、纳差、腹胀症状减轻，5例无明显变化。

二、治疗后患者肝功能的变化

见表1。治疗后8周、12周、24周，干细胞移植组白蛋白较术前及对照组明显回升。

三、治疗后患者凝血功能及Child评分的变化

见表2。术后12周、24周细胞移植组凝血酶原活动度以及术后24周细胞移植组凝血酶原时间较术前明显改善，但差异无统计学意义。术后12周、24周Child评分较术前及对照组明显改善，差异有统计学意义。

四、并发症

干细胞移植组术后出现发热2例，穿刺部位瘀斑2例，1例于术后第2天出现欣快、行为异常，血氨升高，第4天恢复正常(既往曾出现肝性脑病)，1例术后第3天出现黑便，第4天缓解(既往曾出现上消化道出血)。其余患者术中及术后未出现特殊不适。

五、预后

干细胞移植组20例患者中，2例患者于术后6个月死于肝功能衰竭，1例患者于术后8个月死于上消化道出血。对照组22例患者中，1例死于肝肾综合征，1例死于肝性脑病，1例死于上消化道出血。

讨 论

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的细胞，具有广泛迁移和特异的定向特性，能优先定位种植于适当的微环境内而增殖分化，目前已用于多种疾病的治疗，如造血干细胞移植治疗白血病、缺血性心脏病、缺血性下肢血管病等。近年来，骨髓干细胞移植、脐血干细胞移植、间充质干细胞移植等应用于治疗慢性肝病的实验研究及临床观察方兴未艾，并有成功案例报道。姚鹏等［2］报道自体骨髓干细胞经肝动脉移植治疗30例失代偿期肝硬化患者，术后12周患者自觉症状和肝功能在一定程度上改善。Tetai等［3］报道9例肝硬化患者的自体骨髓干细胞移植治疗后，24周血清白蛋白及总蛋白水平均明显提高。韦玲等［4］通过人脐带间充质干细胞移植治疗1例失代偿期肝硬化患者，发现肝功能明显改善且肝细胞脂肪变性及肝纤维化明显减轻。

表1 两组患者治疗前后肝功能变化(±s)

注:与术前比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01;与细胞移植组比较，c P ＜0.05

组别 例数 TBil(μmol/L) ALT(U/L) AST(U/L) Alb(g/L)干细胞移植组20术前 33.93 ±17.83 49.82 ±39.47 76.36 ±62.68 30.49 ±2.75术后4 周 40.42 ±23.77 41.78 ±18.87 71.78 ±42.12 33.76 ±4.48术后8 周 35.49 ±28.73 36.50 ±26.95 56.80 ±39.98 34.40 ±3.59a术后12 周 32.04 ±17.68 37.00 ±18.78 48.56 ±19.26 37.03 ±3.82b术后24 周 30.54 ±18.84 38.10 ±18.56 58.90 ±35.28 36.18 ±5.42b对照组 22术前 37.74 ±26.10 49.55 ±35.33 63.09 ±38.46 31.52 ±3.32术后4 周 34.43 ±19.16 49.17 ±27.66 71.19 ±35.02 33.41 ±2.34术后8 周 38.63 ±21.99 41.55 ±25.69 70.82 ±46.58 30.19 ±4.04c术后12 周 48.40 ±45.38 37.27 ±30.24 64.55 ±52.93 31.68 ±3.06c术后24 周 63.51 ±50.79 41.82 ±32.23 67.64 ±41.79 33.46 ±3.29c

表2 两组患者治疗前后凝血功能及Child评分变化(±s)

表2 两组患者治疗前后凝血功能及Child评分变化(±s)

注:与术前比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01;与对照组比较，c P ＜0.01

Child干细胞移植组组别 例数 PT(S) PTA(%)66 20术前 16.67 ±3.13 52.41 ±14.34 8.10 ±1.07术后4 周 15.34 ±2.55 58.40 ±16.02 7.65 ±0.82术后8 周 15.34 ±2.27 58.07 ±11.74 7.35 ±0.58b术后12 周 14.50 ±1.81 65.99 ±11.22a 6.90 ±0.55bc术后24 周 13.98 ±1.34a 70.08 ±13.27b 6.15 ±0.58bc对照组 22术前 14.77 ±1.74 67.54 ±8.58 8.09 ±1.10术后4 周 13.91 ±1.09 63.04 ±13.92 7.81 ±0.85术后8 周 15.23 ±1.71 61.56 ±12.02 7.78 ±0.86术后12 周 14.36 ±1.64 62.24 ±14.71 7.82 ±0.73术后24 周 14.84 ±2.18 65.62 ±15.68 8.18 ±0.

本研究用自体外周血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化20例，均获成功，未发现有并发症或不良事件发生。整个治疗主要抓住两个关键:其一是外周血干细胞有效适时的采集，把握粒细胞刺激因子给予的量及选择采集的时间是干细胞质量的关键;其二是干细胞移植，在介入条件下经股动脉插管至肝动脉，注入分离好的外周血干细胞悬液。在临床实际应用中要取得最佳疗效仍然有很多客观标志物要观察，如CD34细胞测定就非常重要。

本研究中外周血干细胞移植的失代偿期肝硬化患者术后8、12、24周白蛋白较对照组明显回升;术后12、24周Child评分较术前及对照组明显改善;凝血酶原活动度及凝血酶原时间较术前有所改善，与国内外学者研究结果基本一致［2，5，6］。分析有效性原因:①与干细胞移植后在肝脏微环境下分化形成成熟肝细胞发挥替代功能有关;②干细胞移植改变肝脏免疫微环境［7］，下调免疫介导的肝损伤;③与干细胞的旁分泌功能有关，可通过分泌多种细胞因子调节肝星状细胞(HSC)功能。Tanimoto等［8］研究提示，干细胞可通过调节TNFα、TGFβ的水平抑制HSC的活化从而改善肝纤维化。因此移植干细胞将有可能修复损伤的肝硬化组织，促进肝组织结构重建。动物实验也证实，在干细胞移植肝脏后，不仅可以在肝脏特定的环境下分化为肝系细胞，还可以分泌一些细胞因子，降解纤维化肝组织，参与肝脏的修复［9，10］。

在本研究中干细胞移植患者的安全性也得到进一步证实。Mohamadnejad等［11］对32例自体骨髓干细胞移植的患者进行为期20.5个月的随访观察发现，干细胞移植并未增加肝癌的发生率。因此，自体干细胞移植为大多数终末期肝病患者提供了一种安全、有效、经济的微创治疗方法。尤其在目前白蛋白及凝血酶极为缺乏的现状下，鼓励推广应用就显得迫切。当然，值得注意的是干细胞移植虽然是微创治疗，但对于有明显的脾功能亢进者、病情相对危重者应慎用或者不用，其临床的远期安全性仍有待进一步评估。随着同行们深入的开展、更多的临床观察总结会为更加规范、更加有效的应用干细胞移植手段治疗肝硬化失代偿期患者提供有效依据。

1 中华医学会传染病与寄生虫病学会和肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19:56-62.

2 姚鹏，王帅，胡大荣，等.肝动脉自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化30例.世界华人消化杂志，2001，13:1639-1640.

3 Terai S，Ishikawa T，Omori K，et al.Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bonemarrow cell infusion therapy.Stem Cells，2006，24:2292-2298.

4 韦玲，王莉，李佳，等.干细胞移植治疗肝硬化1例.世界华人消化杂志，2012，20:528-530.

5 Gordon MY，Levicar N，Pai M，et al.Characterization and clinical application ofhuman CD34+stem/progenitor cellpopulationsmobilized into the blood by granulocyte colony-stimulating factor.Stem Cells，2006，24:1822-1830.

6 Piscaglia AC，Shupe TD，Oh SH，et al.Granulocyte-colony stimulating factor promotes liver repair and induces oval cellmigration and proliferation in rats.Gastroenterology，2007，133:619-631.

7 崔丽娜，韩英.多能干细胞在肝脏损伤和修复过程中的免疫调节作用.临床肝胆病杂志，2014，30:855-859.

8 Tanimoto H，Terai S，Taro T，et al.Improvement of liver fibrosis by infusion of cultured cells derived from human bonemarrow.Cell Tissue Res，2013，354:717-728.

9 Lan L，Chen Y，Sun C，et al.Transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells transduced with adenovirus-mediated IL-10 gene reverses liver fibrosis in rats.Transpl Int，2008，21:581-592.

10 Dai LJ，Li HY，Guan LX，et al.The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis.Stem Cell，Res 2009，2:16-25.

11 Mohamadnejad M，Ashrafi M，Alimoghaddam K，et al.Surveillance for hepatocellular carcinoma after autologous stem cell transplantation in cirrhosis.Middle East JDig Dis，2012，4:145-149.

(本文编辑:钱燕)