苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的克隆及原核表达

曹馨月，黄嫒媛，赵 骁，王 敦，冯纪年

(西北农林科技大学，农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，植保资源与病害虫治理教育部重点实验室,陕西 杨凌 712100)

苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的克隆及原核表达

曹馨月，黄嫒媛，赵 骁，王 敦，冯纪年

(西北农林科技大学，农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，植保资源与病害虫治理教育部重点实验室,陕西 杨凌 712100)

【目的】 获得苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全长序列，并在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达，为探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制奠定基础。【方法】 提取苹果蠹蛾触角总RNA，利用RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的全长序列；通过构建原核表达载体pET28a-CpomPBP2对CpomPBP2进行重组表达与检测；并对融合蛋白pET28a-CpomPBP2进行Western blot鉴定及可溶性鉴定。【结果】 以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链，以cDNA为模板经RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR扩增，得到CpomPBP2基因约3 000 bp的全长序列；测序结果表明，CpomPBP2基因开放阅读框长约510 bp，编码169个氨基酸，预测的成熟蛋白分子质量为16.45 ku，等电点(pI)为5.09。经SDS-PAGE电泳分析表明，融合蛋白CpomPBP2以包涵体形式存在，蛋白分子质量约为20 ku。Western blot鉴定结果显示，获得了目标蛋白CpomPBP2。用终浓度1.0 mmol/L IPTG诱导8 h后，可获得大量融合蛋白。【结论】 获得CpomPBP2的全长序列，成功构建了CpomPBP2的原核表达载体，经Western blot鉴定，CpomPBP2表达正确。

苹果蠹蛾；苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ基因；基因克隆；原核表达

苹果蠹蛾(Cydiapomonella)初孵幼虫从果面的损伤处、花萼或梗洼处蛀入果实，直达果心进行为害，常造成严重的经济损失[1]。目前，对苹果蠹蛾的防治主要采用化学杀虫剂、生物药剂及人工防除等方法，但这些方法容易导致苹果蠹蛾的抗药性增强，并对天敌造成严重威胁，且存在防治效果不明显、用药量大等缺点[2-3]，所以需要寻求其他方法控制苹果蠹蛾。有研究表明，利用低浓度性信息素或相关化合物干扰苹果蠹蛾后，能明显影响其寻找配偶，而该方法已被运用于苹果蠹蛾的防治中[4]。

苹果蠹蛾成虫通过嗅觉觅食及寻找配偶，雌蛾寻找产卵场所也要通过嗅觉来完成。在昆虫的触角感受机制中，首先通过气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBPs)和气味分子的相互作用与外界进行信息交流[5]。气味分子为疏水性物质，它通过一定途径到达受体蛋白，穿过细胞间质中的亲水性溶液，即昆虫嗅觉感受器淋巴液，OBPs就存在于亲水性溶液中，且浓度很高，OBPs选择性地与特异气味分子结合，将其运送到嗅觉感受器细胞中[6]。在鳞翅目的蛾类中，性信息素由雌虫分泌，同类群的雄虫通过专一的选择性和特异性对其进行分析、检测，启动交配过程。在雄虫触角中，性信息素结合蛋白(PBPs)运输疏水性信息素分子穿过感器淋巴液到膜结合受体(离子通道)[7-8]，同时保护疏水性信息素分子避免降解酶触发的神经反应，PBPs在不同蛾类中有高度的相似性，超过50%的序列相似[9]。

苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(Pheromone binding protein 2，CpomPBP2)是气味结合蛋白多基因家族的一个分支[10-11]，存在于雄虫的触角中，通常仅位于毛型感受器(Trichoidsensilla)中[12]。雄蛾利用性信息素结合蛋白感受雌蛾发出的性信息素气味分子，与其特异性结合，完成交配。这种雌雄蛾间的信息交流具有专一性，从而形成了种群隔离[13]。为更好地了解PBP2的结构和功能，本研究利用RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR扩增技术获得CpomPBP2基因的序列全长，并在大肠杆菌中进行融合表达，旨在探明苹果蠹蛾雌雄间的信息素交流机制，为苹果蠹蛾的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试虫源 苹果蠹蛾老熟幼虫和蛹采自甘肃省张掖、武威地区，在甘肃农业大学待其羽化后提取RNA并反转录制备cDNA (下文所述cDNA均与此相同)，带回实验室进行后续研究工作。

1.1.2 载体与菌株 克隆载体pMD19-T购自Takara(大连宝生物工程有限公司)，表达载体pET-28a(+)、大肠杆菌菌株TG1和BL21(DE3)由西北农林科技大学昆虫博物馆分子生物学实验室提供。

1.1.3 主要试剂 RNAiso Plus Kit(总RNA抽提试剂盒)、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Marker、蛋白质Marker均为大连宝生物工程有限公司产品，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(反转录试剂盒)购自Fermentas公司，T4 DNA连接酶为Promega产品，IPTG、X-gal、抗生素购自西安沃尔森，DNA胶回收试剂盒为美国Zymo公司产品，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自美国MP Bio公司，HRP-conjugated 6*His-tag Miniclonal Antibody购自Proteintech公司。

1.2 方 法

1.2.1 苹果蠹蛾触角总RNA的提取 将苹果蠹蛾成虫触角放入液氮预冷的研钵中，加入液氮，充分研磨，再加入适量的RNAiso Plus将样品完全覆盖，室温静置直至样品融化。将匀浆液转移至离心管中，室温静置5 min后，4 ℃、12 000g离心5 min，小心吸取上清，移入新的离心管；加入氯仿(RNAiso Plus体积的1/5)振荡15 s，室温静置5 min;4 ℃、12 000g离心15 min,吸取上清液转移至另一新的离心管，加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，30 ℃静置10 min，4 ℃、12 000g离心10 min，小心弃去上清，加入经DEPC处理的体积分数75%乙醇l mL(切勿触及沉淀)，4 ℃、12 000g离心5 min，弃去乙醇，室温干燥沉淀2～5 min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀后于-70 ℃保存。

1.2.2 引物设计与合成 用于扩增苹果蠹蛾PBP2基因的引物，选取Willett[14]所提到的为鳞翅目昆虫PBP基因保守序列设计的简并引物。以苹果蠹蛾cDNA为模板，PCR扩增获得苹果蠹蛾PBP2基因保守区片段序列，再以此序列为基础，用Primer Premier 5.0软件进行3′-RACE引物设计。根据克隆得到的苹果蠹蛾PBP2基因cDNA片段序列，以待扩增的5′末端为方向设计TAIL-PCR引物(表1)。

1.2.3 cDNA片段的克隆 按照反转录试剂盒说明，以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链，以其为模板，利用PF1和PR2引物进行PCR扩增。PCR反应体系共25 μL：10×PCR Buffer(Mg2+Free) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模版适量，TaqDNA聚合酶(5 U/μL ) 0.2 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，然后于-20 ℃保存。

1.2.4 3′-RACE PCR扩增 以苹果蠹蛾触角总RNA为模板，利用3′-RACE反转录试剂盒进行反转录。根据已测序验证的苹果蠹蛾PBP2基因保守区片段序列设计的特异性引物GSP1、GSP2，分别用特异性上游引物和下游锚定引物LUPM、SUPM(表1)配对进行巢氏PCR扩增。

第1次 PCR：PCR 反应体系共25 μL，内含10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，上游引物GSP1(10 μmol/L)1 μL，下游引物LUPM(10 μmol/L)1 μL，cDNA模板适量，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

第2次 PCR(巢氏PCR)：PCR 反应体系共25 μL，内含10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，上游引物GSP2(10 μmol/L)1 μL，下游引物SUPM(10 μmol/L)1 μL，第1次 PCR产物1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，67 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 5′ TAIL-PCR扩增 根据克隆得到的苹果蠹蛾PBP2基因cDNA片段序列，以基因组DNA为模板(基因组DNA的提取采用Biomiga公司生产的昆虫gDNA小量提取试剂盒)，以待扩增的5′末端为方向设计3条嵌套的特异性引物RB0、RB1、RB2和TRB0、TRB1、TRB2，引物RB1设计位置在RB0内侧，RB2位于RB1内侧，这3条引物分别为3轮反应的下游引物。引物LAD1、LAD2、LAD3和LAD4为上游简并引物[15]，用于预扩增的4个平行反应；AC1[15]作为第1和第2轮扩增反应的上游引物(表1)。TRB0、TRB1、TRB2嵌套方式及上游引物等均与RB0、RB1、RB2相同。

TAIL-PCR预扩增反应：反应体系共20 μL,内含10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.0 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，任1种LAD引物(20 μmol/L)1 μL，引物RB0(10 μmol/L)1 μL，DNA模板1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O补足至20 μL。

第1轮反应：反应体系共25 μL，内含10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，引物AC1(10 μmol/L)1 μL，引物RB1(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(预扩增产物稀释50倍)1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O补足至25 μL。

第2轮反应：反应体系共25 μL，内含10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，引物AC1(10 μmol/L)1 μL，引物RB2(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(上一轮扩增产物稀释10倍)1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O补足至25 μL。TAIL-PCR反应条件参考Liu等[15]的方法。TRB0、TRB1、TRB2反应条件和体系与RB0、RB1、RB2相同。

将2次TAIL-PCR扩增所得基因序列与RT-PCR和3′ RACE扩增获得的部分基因序列进行拼接，得到CpomPBP2基因DNA全长序列，利用拼接的全长序列设计扩增CpomPBP2基因全长的引物QCF、QCR(表1)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，并将PCR产物纯化、克隆，对经菌液PCR和酶切鉴定为阳性的克隆进行测序。

1.2.6 苹果蠹蛾PBP2编码框基因的克隆 以cDNA为模板，用带有酶切位点的引物CpomPBP2 F、CpomPBP2 R(表1)进行PCR扩增。PCR反应总体系为25 μL，其中ddH2O 15.3 μL，dNTP Mix(各 2.5 mmol/L)2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，10×PCR Buffer (Mg2+Free)2.5 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测，割胶回收目的条带并纯化，纯化过程按照DNA胶回收试剂盒说明书进行。将回收产物与pMD19-T载体连接，反应体系及反应条件参见Takara公司pMD19-T载体说明书。将连接产物转化到感受态细胞TG1中，涂板于LB固体培养基(含Amp 100 μg/mL，IPTG 24 μg/mL，X-gal 20 μg/mL)，在37 ℃反应12 h，进行蓝白斑筛选。挑取阳性克隆(白斑)进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将部分菌液送上海桑尼生物科技有限公司进行测序鉴定，剩余菌液分装加入体积分数20%～30%甘油于-80 ℃保存。

1.2.7 原核表达载体pET28a-CpomPBP2的构建 将鉴定正确的阳性克隆pMD19-CpomPBP2在含Amp的LB液体培养基中37 ℃过夜培养，pET-28a(+)在含Kana(50 μg/mL)的LB液体培养基中于37 ℃过夜培养。CaCl2碱裂解法分别提取质粒DNA进行BamHⅠ、XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳切胶回收。用T4 DNA连接酶在22 ℃连接30 min，连接产物转化TG1感受态细胞，转化后涂布于含Amp(100 μg/mL)的固体LB培养基于37 ℃培养12 h。蓝白斑筛选获得目的基因原核表达载体pET28a-CpomPBP2，经菌液PCR、酶切鉴定后，再送上海桑尼生物科技有限公司进行测序鉴定，将鉴定正确者转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达。

1.2.8 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的诱导表达及检测 将含有pET28a-CpomPBP2的BL21(DE3)菌液在LB液体培养基(含Kana)中37 ℃过夜培养，以体积比1∶50的量加入到新的LB液体培养基(含Kana)中振荡，培养至OD值为0.5～0.7，加入IPTG使其终浓度分别为0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L，于37 ℃培养 6～8 h。确定最佳诱导浓度后，以最佳IPTG诱导浓度诱导菌液8 h，每隔2 h取1次样，以确定最佳诱导时间。以最佳诱导时间和诱导浓度诱导pET28a(+)和BL21(DE3)。

将上述经不同浓度IPTG和不同时间诱导的样品按每个样品1.5 mL离心收集菌体，用PBS洗涤2次后，用40 μL PBS重悬，以体积比1∶4加入5×SDS-PAGE样品缓冲液，变性处理后经12% SDS-PAGE电泳检测。电泳结束后，经考马斯亮蓝染色、脱色，检测蛋白是否表达及其表达量。

1.2.9 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的Western blot鉴定 因pET28a(+)含有6个His-tag组氨酸标签，可进行抗组氨酸的Western blot鉴定。将SDS-PAGE凝胶用半干法电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，电转结束后，将NC膜置于封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)中4 ℃过夜。用TBST缓冲液洗膜后，以体积比1∶5 000的量加入辣根过氧化物酶HRP作为抗体，孵育1 h，用DAB使膜显色。

1.2.10 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的可溶性鉴定 取优化条件下诱导的融合蛋白pET28a-CpomPBP2菌液,经反复冻融和超声波破碎，离心后分别收集上清和沉淀，沉淀用PBS洗涤后重悬，制成可溶性和不可溶性蛋白样品，用SDS-PAGE进行电泳检测，以明确融合蛋白的可溶性。

2 结果与分析

2.1 苹果蠹蛾PBP2基因cDNA和内含子的克隆与序列分析

以苹果蠹蛾触角总RNA为模板合成cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，利用简并引物PF1和PR2进行PCR扩增，电泳结果显示扩增出了长度约为270 bp的目的条带(图1a)，PCR产物经纯化、克隆、测序获得了长度为276 bp的片段。利用NCBI的Blast工具进行同源性检索，发现由cDNA片段所推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PBP2的同源性很高，并且含有5个保守的半胱氨酸(Cysteine，Cys)位点(全长序列应具有6个)，具有昆虫性信息素结合蛋白基因的典型特征，证明获得的cDNA序列为苹果蠹蛾PBP2基因片段，命名为CpomPBP2。

图1 苹果蠹蛾PBP2基因cDNA中间片段(a)、3′端(b)、5′端(c)和全长(d)的PCR扩增结果
M.DNA 分子量标准；a：1.阴性对照；2.PBP2基因片段克隆; b：1.RACE巢氏PCR扩增产物;c：引物RB1、RB2、TRB1和TRB2的TAIL-PCR扩增结果;d：1.以DNA为模板
Fig.1 PCR amplification of middle segment (a),3′ end (b),5′ end (c) and complete sequence (d) of full length cDNA ofCydiapomonellaPBP2 gene
M.DNA Marker;a:1.Sterile water as negative control,2.Cloning of CpomPBP2 fragment;b:1.3′ RACE nested PCR amplification;c:TAIL-PCR products of RB1,RB2,TRB1 and TRB2;d:1.DNA as template

根据获得的苹果蠹蛾PBP2基因的cDNA序列，设计合成GSP1和GSP2特异性上游引物，并分别与下游锚定引物LUPM、SUPM配对进行巢式PCR扩增，对3′ RACE PCR产物进行电泳分析，目的条带长度约为500 bp (图1b)，PCR产物经过纯化、克隆和测序获得了476 bp的cDNA片段。该序列3′ 端非编码区长120 bp，末端具有真核生物典型的poly(A)结构，并且该poly(A)结构上游41 bp处有1个加尾信号(序列为AATAAA)，表明已经得到目的基因cDNA的3′末端序列。

根据昆虫性信息素结合蛋白保守的基因结构推断，通过RT-PCR和3′ RACE扩增得到的cDNA片段包括了CpomPBP2部分外显子2和全部的外显子3，即在Ala 52和Asp 53之间有1个内含子(图2)，所以分别在外显子2和外显子3区域内设计了用于TAIL-PCR的特异性引物(RB0、RB1、RB2，TRB0、TRB1、TRB2)。以苹果蠹蛾基因组DNA为模板，以根据CpomPBP2基因外显子2、3区域分别设计和合成的特异性引物进行TAIL-PCR扩增。在3区域预扩增中使用LAD3和在2区域预扩增中使用LAD1时扩增结果较理想，分别在第2轮、第3轮扩增时得到了长度约为2 000 bp的条带和大于 2 000 bp的特异性条带，将第2轮PCR产物纯化、克隆后测序，得到1 918 bp和2 537 bp的序列(图1c)。

图2 CpomPBP2部分cDNA序列及氨基酸序列> < 2.内含子2；RB0-RB2、TRB0-TRB2.用于TAIL-PCR扩增的特异性引物
Fig.2 Partial sequences of cDNA and deduced amino acids of CpomPBP2> < 2.Intron 2;RB0-RB2，TRB0-TRB2.Special primers for TAIL-PCR

2.2 苹果蠹蛾PBP2基因DNA全序列的克隆

经PCR扩增得到长度约3 000 bp的特异性条带。将PCR产物纯化、克隆，对经菌液PCR和酶切鉴定为阳性的克隆进行测序，结果表明，CpomPBP2基因开放阅读框全长510 bp，编码169个氨基酸，DNA序列全长3 147 bp，含有2个内含子，在Glu 22和Leu 23之间插入第1个内含子(1 655 bp)，在Ala 82和Asp 83之间插入第2个内含子(862 bp)。经SignalP软件预测，CpomPBP2的N-端前25个氨基酸为信号肽，具有真核生物分泌蛋白信号肽的典型特征，因此CpomPBP2成熟蛋白包括144个氨基酸，预测的分子质量为16.45 ku，等电点为5.09。测序结果与上述拼接的DNA全长序列一致(图1d)。苹果蠹蛾PBP2基因全长DNA序列已在GenBank上注册，登录号为JQ776635。

以cDNA为模板，用带有双酶切位点的引物CpomPBP2 F、CpomPBP2 R进行PCR扩增，得到长度约500 bp的目的片段(图3)，与理论值相符。

2.3 原核表达载体pMD19-CpomPBP2的酶切鉴定和测序结果

用BamHⅠ和XhoⅠ对原核表达载体pMD19-CpomPBP2进行双酶切，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，片段长度约为500 bp(图4)，与预期结果相符。经测序，目的片段与GenBank中苹果蠹蛾PBP2基因(GenBank登录号：JQ776635)阅读编码框序列相吻合,全长510 bp，编码169个氨基酸。说明原核表达载体pMD19-CpomPBP2构建成功。

图3 苹果蠹蛾PBP2编码框基因RT-PCR产物的凝胶电泳结果
M.DNA Marker DL2000；1,2.RT-PCR产物
Fig.3 Gel electrophoresis of RT-PCR products of PBP2 ofCydiapomonella
M.DNA Maker DL2000;1,2.Products of RT-PCR

2.4 原核表达载体pET28a-CpomPBP2的酶切鉴定及测序结果

质粒pMD19-CpomPBP2和pET28a(+)双酶切并连接后，经BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果(图5)表明，分别得到了长度约为5 300和500 bp的片段。经测序公司测序正确，说明成功构建了表达载体。

图4 苹果蠹蛾pMD19-CpomPBP2的双酶切鉴定结果
M.DNA Marker DL2000；1，2.经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pMD19-CpomPBP2
Fig.4 Restriction enzyme identification of pMD19-CpomPBP2 ofCydiapomonella
M.DNA Marker DL2000；1,2.pMD19-CpomPBP2 digested withBamHⅠandXhoⅠ

图5 原核表达载体pET28a-CpomPBP2的酶切鉴定结果
M.DNA Marker DL5000；1，2.经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的pET28a-CpomPBP2
Fig.5 Identification of prokaryotic expression vector pET28a-CpomPBP2
M.DNA Marker DL5000；1，2.pET28a-CpomPBP2 digested withBamHⅠandXhoⅠ

2.5 融合蛋白pET28a-CpomPBP2诱导条件的优化

不同终浓度(0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L) IPTG诱导融合蛋白6～8 h后取样，经12% SDS-PAGE检测，在约20 ku处均有明显的目的条带，说明IPTG诱导浓度对蛋白表达量的影响无明显差异，IPTG诱导浓度在蛋白质表达中为非关键因素(图6)。因而取常见终浓度1.0 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白，每隔2 h取样1次，共取样4次，通过12% SDS-PAGE检测可知，诱导8 h时蛋白的表达量明显大于其他时段(图7)。

图6 不同浓度IPTG诱导下pET28a-CpomPBP2的SDS-PAGE分析结果
M.预染蛋白Marker;1.未诱导的pET28a-CpomPBP2；2～5.终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L IPTG诱导的pET28a-CpomPBP2
Fig.6 SDS-PAGE analysis of pET28a-CpomPBP2 at different IPTG concentrations
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2-5.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG at concentrations of 0.5,1.0,1.5, and 2.0 mmol/L,respectively

图7 不同诱导时间下pET28a-CpomPBP2的SDS-PAGE分析结果
M.预染蛋白Marker；1.未诱导的pET28a-CpomPBP2；2～5.经1 mmol/L的IPTG诱导2，4，6，8 h的pET28a-CpomPBP2
Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant pET28a-CpomPBP2 under different induction times
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2-5.pET28a-CpomPBP2 induced by 1.0 mmol/L IPTG for 2,4,6,and 8 h,respectively

2.6 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的诱导表达及Western blot检测

将原核表达载体pET28a-CpomPBP2转化到BL21(DE3)感受态细胞中，并用IPTG诱导表达，同时将pET28a(+)及BL21(DE3)采用相同条件诱导表达，12% SDS-PAGE凝胶电泳检测结果(图8)表明，未经过IPTG诱导的融合蛋白pET28a-CpomPBP2无明显目的条带，经IPTG诱导的空载体pET28a(+)及未诱导的菌液BL21(DE3)在约20 ku处也无特异性条带，而经IPTG诱导表达的融合蛋白pET28a-CpomPBP2在约20 ku处有明显条带，且与理论值相符。Western blot免疫印迹检测结果(图9)证明，目的条带为pET28a-CpomPBP2蛋白。

图8 IPTG诱导的pET28a-CpomPBP2的SDS-PAGE分析结果
M.预染蛋白Marker；1.未诱导的pET28a-CpomPBP2；2.IPTG诱导的pET28a-CpomPBP2；3.IPTG诱导的pET28a(+)；4.未诱导的BL21(DE3)
Fig.8 SDS-PAGE analysis of IPTG induced pET28a-CpomPBP2
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG;3.pET28a(+) induced by IPTG;4.BL21(DE3) without induction by IPTG

图9 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的Western blot检测结果
M.预染蛋白Marker；1.未诱导的pET28a-CpomPBP2；2.IPTG诱导的pET28a-CpomPBP2；3.IPTG诱导的pET28a(+)；4.未诱导的BL21(DE3)
Fig.9 Western blot analysis of pET28a-CpomPBP2 fused protein
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induced by IPTG;2.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG; 3.pET28a(+) induced by IPTG;4.BL21(DE3) without induction by IPTG

2.7 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的可溶性鉴定

图10表明，融合蛋白pET28a-CpomPBP2在沉淀中以包涵体的形式存在。

图10 融合蛋白pET28a-CpomPBP2菌液裂解后上清与沉淀的SDS-PAGE鉴定结果
M.预染蛋白Marker；1.未诱导的pET28a-CpomPBP2；2.IPTG诱导的pET28a-CpomPBP2;3.IPTG诱导的上清液；4.IPTG诱导的沉淀
Fig.10 SDS-PAGE analysis of bacteria splitting supernatant and sediment of recombinant protein
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG;3.Supernatant induced by IPTG;4.Sediment induced by IPTG

3 讨 论

3.1 苹果蠹蛾PBP2基因全长的克隆

蛾类昆虫的性信息素只有在信息素结合蛋白(PBP)作用下才能到达感器，但不同PBP对不同种类性信息素具有很高的敏感性和专一性[16-17]。Mitsuno等[18]已鉴定出一个小菜蛾(Plutellaxylostella)的性信息素结合蛋白PxlyPBP；陈东旭等[19]对小菜蛾性信息素结合蛋白Ⅰ(PBPⅠ)基因做了相关研究。本试验以苹果蠹蛾触角cDNA为模板，运用RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR扩增技术，克隆了苹果蠹蛾全长约为3 000 bp的PBP2基因，测序结果表明，CpomPBP2基因开放阅读框长510 bp，编码169个氨基酸，N-端前25个氨基酸为预测的信号肽，成熟蛋白由144个氨基酸组成，成熟蛋白分子质量为16.45 ku，等电点(pI)为5.09，与全长引物扩增序列大小一致(GenBank上登录号为JQ776635)，说明已获得了CpomPBP2的全长。

3.2 苹果蠹蛾PBP2基因的原核表达及鉴定

本研究运用PCR技术，根据已获得的苹果蠹蛾PBP2的cDNA序列设计引物，扩增得到PBP2的cDNA编码阅读框序列片段，将该基因片段与pMD19-T连接，经双切酶鉴定后，与表达载体pET-28a(+)构建重组表达载体，将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，获得分子质量约20 ku的融合蛋白，经Western blot分析表明，所获蛋白确为His标签与PBP2的融合蛋白。

3.3 融合蛋白pET28a-CpomPBP2诱导条件的优化

IPTG诱导浓度和诱导时间是融合蛋白pET28a-CpomPBP2诱导过程中的关键因素[20]。本试验结果表明，IPTG诱导浓度对蛋白表达量的影响不明显，因而选用1.0 mmol/L IPTG诱导后，分别在不同时间取样进行12% SDS-PAGE检测，结果表明，在诱导8 h时蛋白表达量最大。因此选用1.0 mmol/L IPTG诱导8 h为最佳诱导条件。

目前，对于苹果蠹蛾性信息素结合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的研究甚少，但对苹果蠹蛾其他气味结合蛋白序列已有报道[21]。对CpomPBP2的作用机制，尤其是对CpomPBP2与其他气味结合蛋白的协调作用以及与不同种气味结合特征等方面的研究还有待深入。本研究结果丰富和完善了对CpomPBP2结构与功能的认识，通过分子克隆技术和原核表达，为进一步探明苹果蠹蛾雌雄间信息素的交流机制奠定了基础，为其防控提供了理论依据。

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Cloning and prokaryotic expression ofCydiapomonellapheromone binding protein Ⅱ gene (CpomPBP2)

CAO Xin-yue,HUANG Ai-yuan,ZHAO Xiao,WANG Dun,FENG Ji-nian

(KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinNorthwesternLoessPlateau,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofPlantProtectionResourcesandPestManagementofMinistryofEducation,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study obtained the cDNA sequence of pheromone binding protein Ⅱ gene ofCydiapomonella(CpomPBP2) and express CpomPBP2 inEscherichiacoliBL21(DE3) to understand the communication mechanism between male and femaleC.pomonella.【Method】 The sequence of CpomPBP2 was obtained using RT-PCR,3′-RACE and 5′ TAIL-PCR methods with extracted total RNA fromC.pomonellaantennae.The DNA segment was inserted into expression plasmid pET28a(+) to construct a recombinant expression plasmid and it was expressed and tested.Western blot characterization and soluble form identification of the fused protein pET28a-CpomPBP2 were also conducted.【Result】 The full-length of obtained cDNA was 3 000 bp with a 510 bp open reading frame,which encoded a protein of 169 amino acids with the molecular weight of 16.45 ku and pI value of 5.09.The SDS-PAGE analysis showed that the cloned fused CpomPBP2 was expressed in the form of inclusion bodies inE.coliBL21(DE3) with a molecular mass of 20 ku.Western blot showed that the fused CpomPBP2 was target protein.Under the 1.0 mmol/L IPTG and 8 h induction,plenty fused protein was obtained. 【Conclusion】 The full-length cDNA of CpomPBP2 was obtained and the fused CpomPBP2 was expressed inE.coliBL21(DE3) successfully.Western blot showed that CpomPBP2 was expressed correctly.

Cydiapomonella;pheromone binding protein Ⅱ gene ofCydiapomonella(CpomPBP2);gene cloning;prokaryotic expression

2013-11-13

公益性行业(农业)科研专项(200903042-03)；陕西省“13115”重大科技专项(2009ZDKG-06)

曹馨月(1988-)，女，甘肃嘉峪关人，在读硕士，主要从事农业昆虫与害虫防治研究。

冯纪年(1957-)，男，陕西白水人，教授，博士生导师，主要从事农业昆虫与害虫防治研究。

时间:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.010

Q786；S436.611.2+9

A

1671-9387(2015)03-0132-09

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.010.html