长枝木霉对白三叶种子发芽及幼苗抗逆性研究

叶 巍，薛应钰，徐秉良，陈 龙

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070)

长枝木霉对白三叶种子发芽及幼苗抗逆性研究

叶 巍，薛应钰，徐秉良，陈 龙

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070)

在室内条件下，用不同浓度的长枝木霉孢子悬浮液对白三叶种子进行处理，研究了其种子发芽率、根芽长及抗逆性酶活变化，以及长枝木霉对白三叶种子的促生作用及抗逆性的影响。结果表明，长枝木霉孢子悬浮液浓度在5.0×105个/mL～1.0×107个/mL时能促进白三叶种子活性，在孢子浓度为1.0×106个/mL时，发芽率为93%，与对照80%相比提高了16.25%；胚根长1.93 cm，与对照1.26 cm相比增长了53.1%；胚芽长1.33 cm，与对照1.04 cm相比增长了27.8%。抗逆性结果表明，长枝木霉孢子悬浮液能够提高白三叶种子抗病害及不良环境的能力，降低MDA含量，提高PAL、POD的活性。其中，孢子悬浮液浓度为5.0×105个/mL时，PAL活性最高，为2.157 U/(g·min) FW；孢子浓度为1.0×106个/mL时POD的活性最高，为29.875 U/g FW；孢子悬浮液浓度5.0×105个/mL时，MDA含量最低，为1.012 μmol/g FW。

木霉菌；孢子悬浮液；白三叶；促生作用；抗逆性

白三叶(Trifoliumrepens)作为一种多年生草本豆科植物分布于世界各地，其含有黄酮类、氨基酸、糖类和维生素等多种营养成分[1]，并且白三叶对铜、铅、镉等重金属有富集作用，可为土壤重金属污染的修复提供科学依据[2，3]。白三叶对土壤要求不严，并且由于其具有抗逆性强、蛋白含量高、耐寒、抗旱、管理费用低、株型低矮等优点被广泛种植[4，5]。虽然白三叶具有多种价值，但随着白三叶的大面积种植，其病虫害的危害日趋严重[6]。因此，如何提高白三叶的抗性成为生产上亟待解决的问题之一。

木霉菌(Trichodermaspp.)属半知菌类的丝孢纲(Hyphomycetes)，广泛存在于森林腐殖质层和农田果园等的土壤中[7]。据不完全统计，木霉菌至少对18属29种植物病原真菌有拮抗作用，由于其具有广谱性、适应性强和多机制的特点而被广泛应用[8]。木霉菌不仅对病原微生物有拮抗作用，而且能直接作用于植物促进其萌发生长和开花，且其本身受外界干扰影响小，因此在植病生防中具有重要的、不可忽视的作用[9]。

已有研究报道了木霉属菌株可以促进植物种子萌发、植株的生长和开花、提高作物产量等[10]。焦琮等[11]发现康氏木霉(T.koningii)活孢可提高棉花和菜豆种子活力[11]，梁志怀等[12]用哈茨木霉(T.harziznum)发酵液对豇豆种子处理后对其幼苗具有促进作用。程玲娟等[13]用深绿木霉(T.viride)对牧草草种进行处理，证明深绿木霉对牧草草种的发芽有明显促生作用。张树武等[14]研究发现，不同稀释倍数深绿木霉发酵液对白三叶的发芽率、发芽指数、POD、PPO等有明显的影响[14]。目前，对促生作用研究较多的木霉是哈茨木霉和深绿木霉，而长枝木霉是我国新鉴定的木霉菌种，有关其促生作用和抗逆性研究与利用报道较少。

试验通过研究不同浓度长枝木霉的孢子悬浮液对白三叶种子的促生效果以及诱导植物抗逆性的影响，为长枝木霉菌剂的开发提供一定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试长枝木霉(T.longibrachiatum)由甘肃农业大学草业学院植物病原学实验室提供；供试的海发白三叶由兰州步亩园林公司提供；使用PDA培养基马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂12 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌的孢子悬浮液对白三叶种子活力的影响测定方法 孢子悬浮液的制备 首先将PDA培养7 d的长枝木霉孢子用无菌水清洗，配置成浓度为1.0×108个/mL孢子悬浮液备用。

孢子悬浮液对白三叶种子萌发率的测定 先将浓度为1.0×108个/mL的长枝木霉孢子悬浮液分别稀释成5个浓度梯度(1.0×107、5.0×106、2.0×106、1.0×106、5.0×105个/mL)，以无菌水为对照，共6个处理。在培养皿中放一张大小适宜的滤纸，每个皿中放入饱满程度基本一致的白三叶种子40粒，每个处理3个重复。再倒入2 mL配好的不同浓度的长枝木霉孢子悬浮液，盖上皿盖，置于25 ℃，12 h/d光照的人工气候培养箱中培养。此后每天对皿中喷2 mL的无菌水。10 d后，吸干白三叶种子表皮的水分，统计发芽率，用直尺测量胚芽长和胚根长。

1.2.2 白三叶种子抗逆性指标的测定 丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定方法，过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法[15，16]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度长枝木霉孢子悬浮液对种子发芽率的影响

长枝木霉孢子悬浮液对白三叶种子发芽率具有明显的促进作用，与对照相比不同浓度孢子悬浮液对种子发芽率的影响存在显著的差异。长枝木霉的孢子悬浮液在浓度为1.0×107，5×106和2.0×106个/mL的条件下可抑制白三叶种子的活力，在浓度为1.0×106、5.0×105个/mL下可以促进白三叶种子的活力。孢子悬浮液浓度在1.0×106个/mL下白三叶种子发芽率最高，为93%，与对照(80%)相比增长了16.25%。孢子悬浮液浓度在1.0×107个/mL白三叶种子发芽率最低，为35%，出现了负增长，与对照80%相比增长率为-56.25%。

图1 不同浓度孢子悬浮液下白三叶种子的发芽率Fig.1 The effect of spore suspension with different concentrations on the seed germination rate

2.2 孢子悬浮液对胚根长与胚芽长的影响

不同浓度长枝木霉孢子悬浮液对白三叶种子的胚根长和胚芽长具有明显的促进作用。与对照相比胚根长随孢子浓度的增加呈先升高后降低的趋势，当孢子浓度1.0×106个/mL时胚根长为1.93 cm，与对照1.26 cm相比增长了53.17%(表1)。浓度在1.0×106个/mL时胚芽长为1.43 cm，与对照1.05 cm相比增长了36.19%(表2)。

2.3 孢子悬浮液对白三叶种子抗逆性指标的影响

2.3.1 丙二醛(MDA)含量 不同浓度长枝木霉孢子悬浮液对白三叶MDA含量影响存在显著的差异，与对照相比处理后白三叶MDA含量随孢子悬浮液浓度的增加而逐渐减小。当孢子悬浮液浓度为5.0×106个/mL时白三叶MDA含量最小，为1.012 μmol/g FW(图2)。

表1 不同浓度的孢子悬浮液下的萌发种子的胚根长Table1 The effect of spore suspension with different concentrations on the root hair length

表2 不同浓度的孢子悬浮液下种子的萌发胚芽长Table2 The effect of spore suspension with different concentrations on the buds length

图2 不同浓度孢子悬浮液下白三叶种子MDA含量Fig.2 The effect of spore suspension with different concentrations on MDA content

2.3.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性 PAL的活性随着长枝木霉孢子悬浮液的浓度变化而变化。在浓度为1.0×107、5.0×106个/mL时PAL活性与对照没有显著差异(P<0.05)。当浓度为5.0×105个/mL时，PAL活性与对照相比差异显著，且达到最大值2.157 U/g·min FW(图3)。

图3 不同浓度孢子悬浮液下白三叶种子PAL活性Fig.3 The effect of spore suspension with different concentrations on PAL activity

2.3.3 过氧化物酶(POD)活性 POD的活性随着长枝木霉孢子悬浮液的浓度变化有明显的变化。在浓度为1.0×107个/mL时POD活性与对照相比有所降低。随着浓度的降低POD的活性逐渐上升，当浓度稀释到1.0×106个/mL时达到最大值29.875 U/g FW，与对照存在显著差异(P<0.05)。

图4 不同浓度孢子悬浮液下白三叶种子POD活性Fig.4 The effect of spore suspension with different concentrations on POD activity

3 讨论与结论

北方地区白三叶的萌发率低，长势差，因此，促进其萌发和生长是当前面临的严峻问题。近年来Chang[17]通过试验证实，当用泥土为基质的哈茨木霉培养物或其分生的孢子悬浮液处理土壤后，辣椒、长春花和菊花等植物均会有发芽率提高、开花早而多、鲜重增加的现象。通过哈茨木霉T22和深绿木霉P1比较处理和未处理根的干鲜重、植株地上部分生物量、株高、叶和果实的数量，得出作物产量提高 300%[18]。试验结果表明，长枝木霉孢子悬浮液在低浓度更能促进生长，在浓度1.0×106个/mL时，对白三叶的发芽率、胚根长和胚芽长的促生效果最明显。这与刘云龙等[19]研究哈茨木霉对辣椒生长和王建峰等研究木霉发酵产物对黄瓜种子活力的结论基本相同[20]。

PAL对植物产生的木质素等起到一定调节作用，与植物抗病性有关，而POD能将植物所产生的H2O2分解，所以与植物抗逆性有关[21]。不同的孢子悬浮液浓度对白三叶的POD和PAL酶活性有一定的影响，都可作为抗病生理指标，诱导植物产生抗病性。试验通过不同浓度的长枝木霉菌孢子悬浮处理白三叶种子后，其POD和PAL酶活性发生了明显变化，抗病性和抗逆性也随之变化，且在一定范围内随孢子悬浮液浓度的增加POD、PAL有所上升，表明适宜浓度处理白三叶种子后可有效提高其抗病性。MDA是膜脂过氧化作用产生的物质，其含量越高说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重，反之则越轻微[21]。长枝木霉菌孢子悬浮液浓度为5.0×106个/mL时，有效的降低了MDA的含量，从而降低白三叶种子的伤害程度，体现出长枝木酶孢子悬浮液在促进植物生长方面的潜能，即在适宜浓度下的长枝木霉孢子悬浮液可以降低对种子的伤害提高植物的抗逆性活力，这将为扩大农业环境中长枝木霉的应用空间、应用范围提供有效的资源和依据。

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Effect ofTrichodermalongibrachiatumon seed growth and resistance of clover

YE Wei,XUE Ying-yu,XU Bing-liang,CHEN Long

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The effect ofTrichodermalongibrachiatumon seeds growth and resistance of clover was studied by measuring the germination rates,root length and resistance of clover treated with different spores concentrations of T.longibrachiatum.The results showed that the vigor of clover seeds was increased after treated with the concentration of 5.0×105to 1.0×107spores/mL ofT.longibrachiatum.The germination rates,root length,shoot length were 93%,1.93 cm and 1.33 cm after treated with the concentration of 1.0×106spores/mL,and which were increased by 16.25%,53.1% and 27.8% compared to control(80%,1.26 cm,1.04 cm),respectively.The spore suspension ofT.longibrachiatumcould enhance the ability of seeds resistance to plant disease and unfavorable environment.The activity of phenylalanine(PAL) and peroxidase(POD) were increased after treated with the spore suspension,but the activity of methane dicarboxylic aldehyde(MDA) was decreased.The maximum activity of PAL and POD were 2.157 U/g(FW)·min and 29.875 U/g(FW) while the spore suspension concentrations were 5.0×105and 1.0×106spores/mL,respectively.The minimum activity of MDA was 1.012μmol/g(FW) treated with 5.0×106spores/mL.

Trichoderma;spore suspension;clover;growth promoting;resistance

2015-03-15；

2015-04-20

甘肃省高校基本科研业务费(甘财教[2012]129号)项目资助

叶巍(1989-),女,吉林省公主岭市人，在读硕士研究生。 E-mail：523133614@qq.com 薛应钰为通讯作者。

S 541.041

A

1009-5500(2015)04-0049-05