流感病毒逃避宿主天然免疫抗病毒应答研究进展

李永涛，王川庆

(1.河南农业大学禽病研究所，郑州 450001；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)

流感病毒逃避宿主天然免疫抗病毒应答研究进展

李永涛1，2，王川庆1*

(1.河南农业大学禽病研究所，郑州 450001；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)

流感病毒是一种重要的呼吸道疾病病原，在人群中每年都会造成地方性流行，因其抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。流感病毒也可在多种动物群体持续传播，偶尔可经动物感染人类并在人群中传播和适应，一定条件下给人类健康造成潜在的威胁。天然免疫应答，特别是干扰素应答是机体早期抵御病毒感染的关键屏障；病毒突破这道屏障，才能成功感染宿主。为对抗病毒感染，宿主细胞利用一系列精密的抗病毒策略：利用模式识别受体识别病毒表达的产物，激活一系列信号级联反应，并导致干扰素等细胞因子的产生；干扰素诱导下游效应分子的表达，进而抑制病毒复制，并辅助机体引发特异性免疫。在与宿主共进化过程中，流感病毒也形成一套完善的拮抗宿主干扰素通路的策略，使病毒能有效地在宿主细胞中感染和传播。最近几年，关于病毒诱导和调控宿主天然免疫应答的研究取得突飞猛进的发展，特别是大量研究发现病毒可以利用各种策略逃避宿主的抗病毒应答。因此，本综述主要介绍流感病毒如何拮抗宿主的干扰素产生而逃避细胞抗病毒应答，有助于揭示流感病毒的致病机制和发现新的抗病毒靶标，从而为防控流感病毒感染奠定基础。

流感病毒；天然免疫；干扰素；免疫逃避

流感病毒是分节段的单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科，包含8个片段，至少编码11种蛋白质。流感病毒内部核心由核蛋白NP和基质蛋白M组成，根据它们抗原性的差异，可分为A、B、C三种类型。其中，A型流感病毒(influenza A virus，IAV)是最重要的病原体，它在人群和动物中呈季节性流行，很大程度上威胁着人类和动物健康。根据囊膜表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗体反应，IAV可再分为16种 HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)，而这些均可从天然宿主水禽体内分离出来[1]。在自然界，IAV宿主众多、分布广泛，给IAV的进化研究与监控带来了很大困难。IAV与其他病原体最大的区别是具有宿主泛嗜性，它几乎可以感染所有家禽、水禽、野禽、水生哺乳动物、马、牛、狗、猪及人等[2]。在与宿主共进化的过程中，IAV 获得多种策略来逃避宿主的免疫反应，从而在宿主群体中持续感染，并不时造成流行或大流行，不仅给畜禽养殖业造成重大的经济损失，而且对人类健康构成严重威胁[3]。IAV 对宿主致病性的强弱在很大程度上与其逃避宿主抗病毒免疫应答能力的强弱有关，因此，深入理解 IAV 如何逃避宿主抗病毒天然免疫应答的策略，不仅有助于揭示 IAV 的致病机制，而且更有利于发现新的药物靶标，从而为 IAV 防控奠定基础。

1 IAV激活干扰素应答

病原微生物感染宿主后，宿主细胞通过体内广泛表达的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)监测病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的存在，PRR被激活后通过招募下游接头蛋白，触发一系列磷酸化或泛素化介导的信号级联反应，最终活化转录因子NF-κB(nuclear factor κB)和干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)，诱导干扰素(interferon，IFN)和促炎性细胞因子的表达[4]。

干扰素是一类低相对分子质量、具有多种生物学活性的细胞因子。根据来源、序列和生物学功能等方面来划分，干扰素分为三大家族，分别是Ⅰ型干扰素(主要包括人体内发现的IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-κ，以及在反刍动物中发现的IFN-τ和小鼠中IFN-ζ等亚家族)、Ⅱ型干扰素(即IFN-γ)以及后来发现的Ⅲ型干扰素(包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3)[5]。目前，在动物疾病防控中，干扰素得到广泛应用。比如，大量的体内和体外试验表明，猪Ⅰ型干扰素对威胁养猪业的许多病毒性传染病均具有很好的抑制作用。有人用IFN-α处理猪的细胞，然后感染各种猪的病毒，结果发现除了猪细小病毒和轮状病毒外，其他病毒的复制都不同程度受到影响，尤其是对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和猪流感病毒(swine influenza virus，SIV)等RNA病毒抗病毒效果非常明显。同样，也有很多文献报道了猪的IFN-β抗病毒谱，除了猪轮状病毒，几乎所有病毒对IFN-β都比较敏感[6-7]。

干扰素产生以后，并不直接发挥抗病毒作用，而是结合在邻近细胞的相应受体——干扰素受体上，并通过下游的JAK-STAT通路激活多种效应分子的表达，如干扰素诱导基因(IFN-induced genes，ISGs)和转录调节因子的表达，从而发挥抗病毒作用。JAK-STAT通路最早是在研究Ⅰ型干扰素信号通路中被发现的，其激活一个三聚体转录因子，是由SH2-磷酸酪氨酸介导的异源二聚体STAT1和STAT2，以及结合的干扰素调节因子9(inteferon regulatory factor 9，IRF9)组成。这样一个三聚体复合物，经活化后进入细胞核与ISGs的启动子元件(IFN-stimulated response element，ISRE)结合，共同组成ISGF3(IFN-stimulated gene factor-3 transcription factor complex 3)激活Ⅰ型和Ⅲ型干扰素诱导的下游基因的转录和表达[8]。

2 IAV逃避干扰素应答

尽管干扰素系统具有强大的抗病毒活性，但是也并不能完全控制IAV的感染。在进化过程中，包括IAV在内的很多病毒已经形成一套完善的拮抗干扰素通路的策略，使得病毒能够有效地在宿主细胞中感染和传播。有趣的是，IAV可以表达多种蛋白质、利用不同途径拮抗或逃避干扰素介导的抗病毒应答。

2.1 NS1蛋白

作为非结构蛋白，NS1蛋白是IAV表达的最重要也是研究最多的干扰素拮抗蛋白，它可以作用于多个靶点、通过多种方式阻止宿主的干扰素应答。NS1蛋白在宿主细胞质和细胞核高度表达，并与细胞质或细胞核的多种参与干扰素通路的蛋白质相互作用，抑制干扰素产生[9]。首先，NS1蛋白利用其氨基端73个氨基酸组成的RNA结合区(RNA binding domain)与病毒的双链RNA(dsRNA)结合，竞争性的抑制dsRNA介导的RLRs(RIG-I-like receptors)、PKR(Protein kinase R)以及OAS(2′-5′oligoadenylate synthetase)的激活。活化的RLRs、PKR以及OAS对细胞抵抗病毒感染起着非常重要的作用。由于OAS与dsRNA亲和力最低，所以NS1与dsRNA的结合大大降低OAS的激活[10]。有趣的是，NS1还能与PKR互作以及通过结合并降低TRIM25活性，有效地抑制PKR和RIG-I的激活以及下游干扰素的产生[11]。当人为突变流感病毒NS1蛋白的第92位氨基酸(天冬氨酸)，NS1蛋白则丧失了抑制RIG-I泛素化激活的能力，说明该位点在NS1蛋白调控干扰素通路中至关重要[12]。此外，还有研究发现在鸭的细胞，流感病毒NS1蛋白可以抑制MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)介导的细胞抗病毒免疫应答，但是具体机制还有待于进一步研究[13]。

前面提到，当细胞被病毒感染时，病毒dsRNA作为激活剂活化PKR，进而诱导抗病毒细胞因子的产生。后来科学家发现一个新的可与PKR互作并激活PKR的蛋白质，命名为PACT(PKR-activating protein)[14]。进一步研究发现PACT还可以通过与RIG-I互作激活RIG-I介导的抗病毒信号通路，证明了PACT在病毒激活干扰素信号通路中必不可少[15]。但是，最近研究发现，流感病毒可以通过其NS1蛋白与PACT发生相互作用，干扰PACT与RIG-I以及PKR的互作，最终破坏了二者介导的细胞抗病毒应答[16]。

其次，NS1还可以通过抑制细胞核内宿主mRNA的加工，进而抑制宿主基因(包括抗病毒基因)表达。其抑制功能主要通过与宿主因子CPSF30(30kDa subunit of the cleavage and polyadenylation factor)的互作以及抑制宿主细胞mRNA由细胞核向细胞质转运来实现[17]。一般来讲，NS1不但抑制宿主的干扰素表达，还抑制ISGs的表达。现在已经知道了NS1结合dsRNA和CPSF30的结构，通过人为突变这些结合位点，构建出的重配病毒则丧失拮抗干扰素应答的能力。然而，在IAV毒株中，NS1对CPSF30 抑制效应并不是保守的，很多病毒没有结合CPSF30的能力，如2009年新出现的H1N1大流行病毒(2009/H1N1)。即便如此，2009/H1N1病毒仍能成功感染人并在人群中传播。需要注意的是，将2009/H1N1病毒人为突变使其获得与CPSF30结合的能力，并不能增强其在小鼠上的复制和致病力[18]。因此，在其他IAV毒株上肯定还存在其他的机制弥补NS1功能的缺乏。

此外，早期有人发现NS1蛋白可以通过抑制NF-κB活性降低IFN-α和IFN-β的产生，但是具体机制不太清楚[19]。后来，有报道显示NS1蛋白通过与NF-κB通路中重要激酶IKKα和IKKβ存在相互作用进而阻止这些激酶的磷酸化，最终破坏NF-κB复合物的入核和下游基因的表达，包括干扰素的产生[20-21]。IAV不但可以在RLRs介导的信号通路中抑制干扰素产生，而且还可以通过JAK-STAT通路阻止干扰素介导的下游信号通路，减弱干扰素诱导的下游效应分子的抗病毒作用。具体说来，NS1主要通过降低STAT1、STAT2和STAT3磷酸化水平进而抑制STAT2进入细胞核以及与ISGs启动子区DNA序列的结合，从而抑制了ISGs和干扰素的表达[22]。

最近，研究者发现人类机体细胞产生的名为DDX21(DEAD box helicase 21)的蛋白质可以有效阻断流感病毒的复制过程，但是流感病毒产生的NS1蛋白可以反过来阻断蛋白质DDX21的功能并且促进病毒复制。流感病毒正是利用了NS1蛋白来作为逃避机体天然防御机制的盾牌[23]。

除了可以拮抗干扰素以及下游通路，NS1还参与了病毒感染的其他过程，这也反映出NS1多功能的特点。在病毒感染的不同阶段，NS1蛋白如何协调诸多功能仍然不清楚，未来这也将是一个有趣的研究方向。

2.2 PB1-F2蛋白

一些IAV毒株的PB1基因具有第二个开放阅读框，可以编码由80个氨基酸组成的多肽，即PB1-F2蛋白。PB1-F2也是IAV一个重要的毒力因子，具有独特的多态性。比如1918年大流行IAV，其PB1-F2的66位氨基酸由天冬酰胺变成丝氨酸，与其毒力增强密切相关[24]。当PB1-F2的66位氨基酸由N变成S后，病毒拮抗干扰素的能力显著上升，这也是66位突变后病毒毒力增强的一个原因[25]。后来发现，PB1-F2有一个线粒体定位信号，通过与线粒体上干扰素通路重要的接头蛋白——线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS，也称IPS-1、VISA或Cardif)互作以及降低线粒体膜电势来拮抗RLRs介导的干扰素信号通路[26-27]。有趣的是，也有报道PB1-F2可以抑制宿主的炎症应答，降低NF-κB通路介导的细胞因子(如IL-1β、IL-6和IL-8)的产生[28]。最近，有人进一步证实PB1-F2与IKKβ相互作用，通过未知的机制阻止激活的NF-κB进入细胞核后与相应启动子的结合，最终降低炎症相关细胞因子的产生[29]。

2.3 PB2蛋白

PB1-F2并不是唯一可以定位在线粒体的IAV蛋白质。病毒的聚合酶复合物中另一成员PB2蛋白，也可以定位到线粒体；不过在病毒开始复制时，PB2主要在细胞核存在。通过系统生物学分析病毒蛋白质与宿主蛋白质的相互作用，已经揭示了病毒的PB2蛋白也具有干扰素拮抗功能[30]。进一步的研究显示，与PB1-F2作用机制相似，PB2也是通过与MAVS相互作用进而逃避宿主的干扰素抗病毒应答[31]。同样有趣的是，一些具备特殊PB2蛋白的病毒的聚合酶活性非常高，复制速度很快，因此可以间接逃避宿主的干扰素应答[32]。最近，本实验室赵宗正等[33]发现PB2蛋白第588位氨基酸由T突变为I可以增强2009/H1N1 IAV拮抗宿主干扰素应答的能力，进而导致病毒毒力的显著增强。

2.4 病毒编码的其他蛋白质

流感病毒的NS1、PB1-F2和PB2蛋白并不是仅有的可以拮抗宿主干扰素应答的蛋白质。最近，S.Liedmann等通过比较两株对干扰素诱导能力不同的流感病毒的基因差异，发现流感病毒编码的聚合酶蛋白PB1和PA也能够参与调节宿主的干扰素产生水平，暗示PB1和PA可能也是潜在的干扰素拮抗蛋白[34]。

IAV的M2蛋白是一个小分子离子通道跨膜蛋白，在病毒膜融合过程中参与病毒核糖核蛋白的有效脱壳。最近，有人发现，M2蛋白可以干扰宿主的自噬过程[35]。病毒感染过程中，Toll样受体(TLRs)的激活离不开细胞自噬，提示M2蛋白可能利用这个机制抑制TLRs通路的激活和干扰素的产生。但是，这也需要进一步的证实。

我们知道，除了编码公认的11个蛋白质，流感病毒还可以编码PA-X、PA-N155、PA-N182和N40等其他几个非结构蛋白[36]。虽然这些蛋白质只是在流感病毒复制过程中短暂出现，但是它们是否如NS1蛋白一样，也参与病毒逃避宿主的天然免疫抗病毒应答，仍需要进一步探索。

2.5 利用宿主因子

从已有的文献资料看，多数研究聚焦病毒编码的蛋白质如何拮抗宿主的天然免疫应答，很少涉及到病毒利用宿主因子逃避细胞抗病毒应答，因此这方面的研究进展是很缓慢的。事实上，除了利用病毒自身合成的蛋白质直接拮抗干扰素，病毒还巧妙地利用特异性的细胞负调控因子来降低干扰素的抗病毒效果[22，37]。比如，IAV感染导致SOCS(suppressors-of-cytokine-signaling)蛋白上调表达，SOCS蛋白主要参与拮抗干扰素信号通路。此外，IAV还可以诱导细胞PKR抑制蛋白P58(IPK)的表达，间接抑制PKR激活。这个过程需要病毒诱导的P58蛋白从HSP40解离。最近，K.Sharma 等[38]发现，病毒NP蛋白也参与P58解离，因此，可以说NP和NS1蛋白共同抑制PKR激活。LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)也是IAV利用宿主拮抗分子抑制干扰素产生的一个手段。LGP2与RIG-I同属于RLRs家族蛋白，二者在IAV引起干扰素生成后都能上调表达，但是它们的功能截然相反。RIG-I是结合病毒RNA诱导干扰产生的主要的模式识别受体，在细胞抗病毒免疫应答中起着关键作用；相反，LGP2却是一个拮抗干扰素产生的负调控分子，因为其缺乏结合病毒RNA的关键结构域，而只有一个抑制结构域，所以在病毒感染过程中抑制了干扰素的产生[39]。有些IAV毒株在感染过程中诱导LGP2上调表达，间接辅助病毒逃逸细胞免疫应答。

在 IAV等包膜病毒的病毒颗粒中，除包含病毒编码的结构蛋白外，还包含来源于宿主细胞的多种蛋白质。2008年，M.L.Shaw等[40]首次通过蛋白质组学方法对在Vero细胞中增殖的流感病毒进行分析，发现成熟的病毒颗粒结合有36种宿主蛋白质。目前，对这些宿主蛋白在IAV逃逸细胞抗病毒免疫应答过程中所起作用的研究还很有限。最近，F.Berri等[41]发现IAV包装的宿主膜连蛋白Annexin V可以抑制IFN-γ介导的抗病毒应答信号。同时，我们和其他研究者均发现IAV包装的另外一个宿主蛋白质——热休克蛋白27(HSP27)可以被病毒诱导表达以拮抗宿主的干扰素应答，从而逃避机体抗病毒免疫反应[42]。我们发现，流感病毒诱导的HSP27主要通过靶向干扰素信号通路中的TRAF3和TRAF6蛋白，导致二者发生泛素化降解，从而阻断干扰素的产生[43]。未来需要系统性筛选还有哪些病毒包装的宿主蛋白质可以帮助病毒逃逸宿主的免疫应答，以及揭示这些宿主蛋白质通过哪些方式或机制拮抗宿主抗病毒天然免疫应答。

2.6 利用宿主蛋白修饰系统

S．Pal等[44]曾经开创性地探索IAV与宿主小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)之间的联系，首次报道并发现IAV 的NS1蛋白是该病毒已知的第一个SUMO化修饰的靶蛋白，NS1蛋白的SUMO化修饰丰度非常高。接着，他们又发现NS1蛋白不但受SUMO1化修饰，而且还受SUMO2/3修饰，并且发现NS1蛋白219位和70位氨基酸是关键修饰位点。通过拯救不能被SUMO修饰的突变病毒发现，突变病毒的增殖显著下降，抑制干扰素信号通路的能力也大大降低，提示NS1蛋白可能利用宿主蛋白SUMO修饰系统获得最大的逃避机体抗病毒应答的能力[45]。最近，中科院上海巴斯德研究所分子病毒课题组发现流感病毒核蛋白NP同样利用人细胞的SUMO修饰系统将自身进行翻译后修饰，同时还找到了调控NP蛋白SUMO化的特异性E3泛素化酶PIASxa，这对深入揭示流感病毒的致病性和抗病毒治疗具有重要意义[46]。

3 干扰素系统对IAV的宿主嗜性和致病性的影响

尽管IAV可以利用不同蛋白质在多个层次拮抗细胞干扰素应答，但是干扰素仍然是防治急性流感感染的关键策略。有人利用小鼠模型发现当敲除干扰素基因时，IAV的复制能力和对小鼠的致病力大大提高；而当干扰素存在时，则能很好的保护小鼠存活[47]。因此，IAV 对宿主致病性的强弱在很大程度上与其逃避宿主抗病毒免疫应答能力的高低有关。IAV拮抗干扰素的产生都会涉及到与宿主蛋白质的相互作用，这种互作很大程度上决定了病毒的宿主嗜性，因为一些毒株在特异性宿主已经适应以便于抑制干扰素通路相关的宿主因子。大量研究表明，病毒NS1拮抗干扰素的特征是病毒复制和持续感染的前提[48]。并且，NS1不但影响天然免疫，还影响后续的获得性免疫。基于非结构蛋白NS1作为IAV最重要的毒力因子，这就可以将NS1基因进行人工突变获得重配的弱毒株，使之成为有效的候选疫苗[49]。另外，通过靶向抑制NS1蛋白的功能这一策略，可以筛选小分子抗IAV化合物。最近有人鉴定出一个小分子化合物可以阻止NS1蛋白对细胞基因表达的拮抗能力，并且有效抑制IAV的复制[50]。今后的研究重点可能需要发掘更多的能够帮助病毒逃逸细胞抗病毒应答的宿主因子，并构建一系列相应宿主因子基因过表达细胞系，以期发现更好的细胞株供病毒增殖和疫苗生产。通过以上这些途径能否开发出新的疫苗平台和抗病毒药物，以便用于IAV的预防和治疗，仍需要后续的研究来确定。因此，深入理解 IAV 如何逃避宿主抗病毒天然免疫应答的策略，不仅有助于揭示 IAV 的致病机制，而且有助于发现新的抗病毒药物靶标，从而为 IAV 的防控奠定基础。

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(编辑 白永平)

Evasion of Host Innate Immune Antiviral Responses by Influenza Viruses

LI Yong-tao1，2，WANG Chuan-qing1*

(1.InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450001，China；2.StateKeyLaboratoryofAgricultureMicrobiology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

Influenza virus is an important respiratory pathogen，which can bring endemic infection in people every year，and can cause worldwide pandemic due to its easy variation of antigenicity.Influenza viruses can also spread in a variety of animal populations，transmit occasionally from animal species to the humans and spread in the population，resulting in potential threats to human health under certain conditions.Host innate immune response，especially early interferon response is the body’s first defense barrier against viral infections.Viruses must breakthrough that barrier in order to successfully infect the host.To fight viral infections，the host cells use a range of sophisticated anti-viral strategies：the cells firstly use pattern recognition receptor to recognize viral products，and then activate signaling cascades，leading to a range of interferon and other cytokines；downstream effector molecules are induced by interferons and inhibit viral replication；the activated cytokines contribute to adapted immune response.In the process of co-evolution with the host，influenza virus also develops perfect antagonist strategies to host interferon pathway，which help virus infect the host and spread efficiently in host cell.In recent years，the studies on how virus induces and modulates host innate immune response have made rapid development，and a large study found that the virus can utilize a variety of strategies to evade host antiviral response.Therefore，this review focuses on how influenza virus antagonizes host interferon production and evades cellular antiviral response，which will be contributed to uncover the pathogenicity mechanisms of influenza virus and reveal novel antiviral targets for the prevention and control of influenza infection.

influenza virus；innate immune；interferon；immune evasion

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.003

2014-08-18

河南省高校科技创新团队支持计划(14IRTSTHN015)；河南省高校科技创新人才支持计划(14HASTIT022)；华中农业大学农业微生物学国家重点实验室开放基金(AMLKF201308)

李永涛(1985-)，男，河南西华人，讲师，博士，主要从事畜禽天然免疫研究，E-mail：yongtaole@126.com，Tel：0371-63555516

*通信作者：王川庆，教授，E-mail:wchuanq@163.com

S852.659.5；S852.4

A

0366-6964(2015)04-0526-08