禽网状内皮组织增生病毒检测方法研究进展

谭海滨，李继昌*

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.008

禽网状内皮组织增生病毒检测方法研究进展

谭海滨，李继昌*

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.008

禽网状内皮组织增生病毒（REV）属于反转录病毒属。此病毒主要感染火鸡、鹅、鸡、鹤鹑和鸭等禽类并引起以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤性病理综合征。禽网状内皮组织增生病与鸡马立克氏病（MD）和鸡淋巴细胞白血病（AL）均是禽病毒性肿瘤性疾病，且都可以引起严重的免疫抑制。目前，因为REV等免疫抑制性疾病所造成的直接或由于疫苗带毒所造成的间接损失已日益成为影响养禽生产和养殖效益的严重因素。

目前，对REV的检测国内外已经建立了多种检测方法：如聚合酶链式反应（PCR）、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法、间接免疫荧光（IFA）、病毒中和试验（NT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和核酸探针法等。但是由于前些年我国对REV在鸡群危害的严重性认识不够，直到目前为止我国尚未建立自己的REV商品化的监测手段，大部分的规模化养鸡场还没有将REV的监测纳入日常工作范畴，但是对于目前REV的发展势头、对养禽业的危害和国内外经济贸易的需求来看，广泛地开展REV的监测已经是大势所趋，研究并确立符合我国养鸡业的REV检测方法,不仅适合我国养禽业的技术需求，且具备了巨大的市场潜力，一定会产生深远的社会效益和经济效益。现重点对目前HVT疫苗中污染物REV检测的PCR、RT-PCR和IFA三种较为常用的检测方法的国内外研究进展做如下介绍：

1 PCR技术用于检测REV的研究进展

PCR（polymerase chain raction）技术是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA在体内复制的DNA快速扩增的方法，这项技术于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR是一种看起来简单的体外扩增DNA序列的技术，具有特异、敏感、产率高，快速、简便，重复性好、易自动化等突出优点。能在一个Ephendof管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术已经渗透到各项疫病的检测，并且已经应用到REV的检测中。应用PCR方法检测REV是基于REV反转录病毒复制周期、RNA转化为DNA。REV的前病毒DNA插入到宿主细胞的DNA中，因此直接提取组织或者细胞的DNA，应用PCR法即可直接扩增出目的片段，达到检测的目的。REV的LTR序列非常稳定，且不同毒株之间的差异非常小。1993年，Aly等首先根据REV的LTR序列设计了引物建立了普通PCR方法检测到了REV的前病毒DNA。Diallo、hertig等人用PCR方法从马立克氏病疫苗、禽痘疫苗和新城疫疫苗中检测到了污染的REV，并发现使用这些疫苗后鸡产生了矮小综合征和肿瘤。2007年，sllval利用PCR方法对商品马立克氏病疫苗进行检测，检测到了REV病毒的污染。国内翟新验等利用前病毒长末端重复序列（LTR）区设计引物进行扩增，建立了PCR检测禽REV的方法，该方法可以检测出SNV毒株，且和MDV等病毒无交叉反应，特异性较好，但是未能检测出REV-T毒株。赵丽青等，在Light Cycler建立平台基础上，利用SYBR GreenI染料能特异性地与双链DNA结合而发出荧光的特性，建立了一种荧光PCR方法检测REV的方法，病毒的最低检出浓度为10-7。本方法的建立为开展HVT疫苗中污染物REV的检测提供了一种快速、有效、灵敏的方法，它即可以作为REV分子流行病学调查的一种方法，也可以作为REV确诊的实验室诊断方法，并且可以进行大批量检测。

2 RT-PCR方法检测REV的研究进展

RT-PCR（reverse transcription PCR）是反转录-聚合酶链式反应的缩写，是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR过程中，一条RNA链首先被逆转录成为互补DNA，然后再以此DNA为模板通过PCR进行DNA扩增。由于反转录与PCP反应在同一反应体系进行,大大的提高了RT-PCR的反应效率。目前关于应用RT-PCR方法检测REV的报道相对较少。在国内，葛菲菲从已经感染了REV-T株的鸡胚成纤维细胞中抽提出染色体DNA，并将此作为模板用于PCR检测，同时采用Trizol方法提取病毒RNA并作为模板,进行RT-PCR反应，通过此方法扩增出来的基因片段和理论值基本一致，该RT-PCR方法的灵敏度是10-4稀释倍数，与其他病毒没有交叉反应，结果证明应用RT-PCR方法检测REV是一种灵敏且特异的方法，初步建立了REV的RT-PCR检测方法。毕研丽等根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒的基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,同时优化了三重RT-PCR反应条件，建立了3种病毒的三重RT-PCR技术，该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。

3 间接免疫荧光法（IFA）用于检测REV的研究进展

免疫荧光技术就是应用抗原和抗体可以结合的特性，同时结合荧光色素标记技术，使其反应的结果可以在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。间接免疫荧光法是将待检细胞首先用未标记的抗体处理，在抗原抗体形成免疫复合物后，再用荧光标记的二抗与其反应，即可检测出特异抗原在细胞中的存在部位，具有荧光增强效应。该方法具备荧光效率高，标记后下降不明显、荧光色泽与背景色泽对比鲜明、标记后能保持生物学活性和免疫活性、标记方法简单、快速，安全无毒等特点。国内最早荣骏弓用禽网状内皮组织增生病病毒（REV）感染SPF鸡胚次代成纤维细胞涂片为抗原，确定了待检血清稀释度和兔抗鸡IgG荧光抗体的稀释度工作浓度，建立了检测REV抗体的间接免疫荧光法（IFA）。刘绍琼等分别用免疫组织化学（IHC）法、间接免疫荧光（IFA）法对肿瘤病鸡不同脏器中的禽网状内皮增生病病毒（REV）进行了检测，两种方法均在肿瘤病鸡的肿瘤、法氏囊、骨髓、肝脏、心脏、脾脏、腺胃等组织切片和触片中检测出了REV，两种方法的检测结果完全吻合。IHC法检测结果显示不同组织的细胞被染成褐色或深褐色，IFA法检测结果显示不同组织的细胞内均可见亮绿色荧光。结果表明，IHC法与IFA法均可用于检测不同脏器中REV的分布，具有直观、染色特异性强和简便快速的特点。IFA检测方法均能够对抗原进行精确定位，避免了在采样过程中各组织交叉污染而造成检测结果的可靠性降低，该方法将有利于禽网状内皮增生病的诊断并为生产实践提供实验依据。

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★通讯作者