Klotho在肾脏损伤疾病中的作用研究进展

赵洪刚 综述，张遵城 审校

(天津医科大学第二医院核医学科 300210)

·综 述·

Klotho在肾脏损伤疾病中的作用研究进展

赵洪刚 综述，张遵城 审校

(天津医科大学第二医院核医学科 300210)

Klotho;急性肾损伤;慢性肾脏病;高磷血症;血管钙化

虽然经过长期的发展，目前急慢性肾脏病的肾脏替代治疗有了很大的提高，挽救很多人的生命，但是对疾病进展的研究却收效甚微。在积极对肾脏病进行一级、二级预防的同时，也不断增加对肾脏保护性的研究。肾脏保护性因子Klotho基因最初在小鼠模型中被发现。因其表达增高能够延缓衰老，延长生命，所以就用希腊神话中掌管人生命女神Klotho的名字命名。在对Klotho的研究过程中人们逐渐发现，其在调整机体磷代谢中也起到重要作用。特别是近几年的研究发现，血磷和病死率之间存在密切的关系，钙磷失衡导致的血管钙化是心血管疾病独立的强危险因素[1]，甚至认为磷在循环过程中可能对机体起到毒性作用。而Klotho的作用也逐渐得到人们的重视。近年发现，Klotho不仅能作为肾损伤的标志物，减缓肾脏损伤促进修复，而且可能在软组织钙化中起到保护性作用。目前的研究更倾向于认为，膜外的磷对细胞有毒性作用，而尿磷的排泄减少可能会导致机体的早熟和衰老[2]。本文将对其在磷代谢、减缓肾损伤和减少软组织钙化中的作用进行综述。

1 成纤维细胞生长因子-23(fibroblast growth factor-23，FGF-23)和Klotho在机体磷代谢中的作用

高血磷现象普遍存在于慢性肾脏病终末期，由其所带来的并发症严重影响患者的生活质量。对于高血磷一种可能的解释为矫枉过正(trade-off theory)理论，即随着肾功能的下降，导致磷潴留，最终导致低钙血症和甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)增高。FGF-23在磷代谢中起到重要作用，并可以作用于1-α羟化酶，影响血钙的代谢。在慢性肾脏病进展的过程中，血磷的调节不仅依靠FGF-23，还需要Klotho的参与，二者不可或缺。故在钙磷代谢研究中常把二者结合起来。

FGF-23来自成纤维细胞生长因子(FGFs)家族。FGFs家族由包括120个高保守氨基酸残基和多变的N末端和C末端残基组成。通过分析得知，人类的FGFs有7个亚家族。其中的FGF-23主要调节血磷和1，25(OH)2VitD3在体内的平衡。

FGF-23主要由成骨细胞和骨细胞合成。共有251个氨基酸，相对分子质量为26×103。FGF-23包括氨基末端信号肽(1～24残基)、FGF-23样序列(25～180残基)及其他FGF亚家族成员不同的羧基末端延长序列(181～251残基)。在FGF-23分子的氨基末端具有FGF受体结合位点，羧基末端具有Klotho蛋白的结合位点，这是FGF-23行使其功能的分子结构基础。健康人循环中FGF-23半衰期为58 min。有研究发现[3]FGF-23 的增加是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)预后不良的表现。ArMORR研究提示[4]，FGF-23水平升高是维持性血液透析患者一年生存时间的独立危险因素。较血磷而言是更强有力的病死率预测因子。

Klotho在人体中有两种存在形式：膜型和游离型。膜型主要表达于近端肾小管上皮细胞，为激素受体，主要功能为调节磷排泄和合成活性维生素D。游离型Klotho作为体液因子，在机体中起到多样化作用，如抑制生长因子信号、减缓氧化应激、调节离子通道和载体等。1997年由Kuro等[5]发现。其为130×103的跨膜β葡萄糖醛羧酶，能水解类固醇β葡萄糖醛酸。有研究发现，基因敲除Klotho的大鼠，表现为老化加速和动脉粥样硬化[1]。现在已经证实，Klotho和FGF-R复合体较Klotho和FGF-23-R，对FGF-23具有更高的亲和力。也就是说，FGF-23通过依赖Klotho的FGF受体结合发挥生物学效应。研究证实，FGF-R分布广泛，但是膜性Klotho仅表达于肾小管上皮细胞、甲状旁腺和脉络丛等处，这种分布特点决定了FGF-23的作用具有组织选择性。而游离型Klotho则可以在不依赖FGF-23的情况下在机体中发挥多样化的作用。游离型Klotho可以通过肾小管远端内皮细胞TRPV5的表达而限制钙离子的重吸收。其可能在磷的代谢中起到一定的作用。

FGF-23能促进尿磷排泄。其作用机制为：肾脏主要通过近端肾小管细胞刷状缘上的钠-磷协同转运蛋白Ⅱ(Na-PiⅡ)调节尿磷的重吸收。其中起作用的主要是钠-磷协同转运蛋白Ⅱa(Na-PiⅡa)，另有近1/3的尿磷的重吸收是通过钠磷协同蛋白Ⅱc(Na-PiⅡc)。FGF-23通过调节近端肾小管Na-PiⅡa(也可能示Na-PiⅡc)的表达下降，实现对尿磷的调节。过度表达FGF-23的大鼠肾脏Na-Pi协同蛋白表达下降，尿磷排泄增加，而FGF-23失活小鼠则表现为高磷血症。此外，FGF-23还可通过VitD依赖途径，降低小肠Na-PiⅡb的活性，减少胃肠道对磷的重吸收[6]。

增加或限制磷的摄入、口服磷结合剂均可影响血清FGF-23的水平。研究发现FGF-23可抑制1-α羟化酶，使1,25(OH)2VitD3生成减少、分解加速，此种情况说明，其对维持血磷的长期稳定可能发挥重要作用。而血PTH对血磷的反应较为迅速，可能主要负责短期血磷的调节。

CKD患者随着肾脏清除率的下降，FGF-23水平逐渐增加。但是研究发现合成明显增加才是FGF-23血清水平升高的主要原因。这可能是患者肾单位减少导致磷排泄不足的生理性代偿机制。FGF-23的增高可增加尿磷的排泄，并可通过抑制1-α羟化酶而间接使1,25(OH)2VitD3合成下降，减少胃肠道对磷的吸收。在肾功能不全早期，在一定的肾单位下，FGF-23的过度分泌可使血磷在相当长的时间里维持在正常范围。Hsieh等[8]发现，CKD患者中Klotho表达下降，导致FGF-23的功能不能充分的发挥。这也是FGF-23代偿性增加的因素。有人测量，在CKD5期，FGF-23水平可达到健康人的100倍以上[7]。

2 急慢性肾损伤中Klotho的变化规律

急性肾损伤的主要病因为中毒和缺血缺氧。在对急慢性肾损伤的研究中[9]，逐渐发现在急慢性肾损伤时Klotho水平下降。其可能与单核细胞趋化因子-1在急慢性肾损伤中起缓和和保护性作用有关。Klotho具有细胞保护作用，主要表现在能够抵御氧化应激和缺血再灌注损伤。血清Klotho水平是预测残余肾功能和肾脏清除磷能力的指标[10]。衰老、肾脏病、氧化应激之间具有相似性且关系密切[11-12]。

氧化应激、缺血再灌注损伤和血压升高能够导致急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)。国外有研究观察到，Klotho蛋白水平在肾脏和肾脏细胞株中的表达减少。在慢性肾脏病和相关的动物模型中，均检测到Klotho水平减低[13]。肾脏为膜型Klotho的主要表达器官，因此在肾脏受到严重损伤时，Klotho表达减低。但是至今尚没有在急慢性肾损伤的相关数据。最近国外有报道[14]，提示在啮齿类动物AKI时血液、肾脏和尿液中，Klotho蛋白均有急剧的下降，而且在肾脏修复后能够完全恢复。这种现象提示AKI时，Klotho处于低水平状态。AKI时Klotho急剧减少的机制尚不清楚。研究结果显示，在Klotho急剧减少时，Klotho mRNA减少的幅度并不大，而且Klotho的转运RNA仅下降50%，而且Klotho的减少早于其他的肾损伤标志物。实验发现[15]，在培养细胞株出现氧化应激时，Klotho mRNA和Klotho蛋白均明显减少。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)能够减少Klotho mRNA和Klotho蛋白[16]。但是，在AKI中，是不是TNF和INF-γ的作用降低了Klotho mRNA和Klotho蛋白尚不明确[17]。

AKI如何进展为CKD和CKD过程中如何合并AKI的机制尚不明确。目前有多种学说解释这个慢性的不可逆的病理过程。终末期肾病的患者和试验动物，其肾脏中的Klotho水平均是降低的，但是在他们的血液和尿液中，也存在Klotho水平的下降。重要的是，Klotho的减少在CKD的第1期和第2期就已经出现，在啮齿类动物和人类中其下降的程度与肾小球滤过率呈正相关。尿液中的Klotho含量是CKD病程变化非常敏感的指标，而且其下降与肾功能下降是平衡的。Klotho在AKI和CKD中的下降的机制有待于研究，其可能对阻断和延缓肾脏病进展的治疗起到一定作用。

3 Klotho对肾脏保护的机制

肾脏为非可再生器官，而且在CKD进展过程中，目前尚无有效的阻止肾功能继续恶化的方法，这让肾脏的保护显得尤为重要。Hu和他的团队完成了含有不同浓度Klotho 的AKI和CKD的小鼠模型的建立[18]。低水平组为杂合子，Kl+/-；对照组为正常表达；高水平组为转基因制备高表达Klotho和Tg-Kl。在AKI模型中，低表达组Kl+/-小鼠，血清中的Klotho为低表达，尿和肾脏中的为常规水平。此组最终导致了严重的肾脏病。相反在高表达组，由于血清、肾脏和尿中的Klotho水平相对于其他两组高，故对缺血再灌注损伤有较强的抵抗力。这些现象表明，Klotho减少加重了AKI的损伤，而其高表达则减弱了AKI的损伤。HU和他的团队[14]在肾损伤30～60 min后，将重组的Klotho蛋白注入肾损伤的动物体内，结果观察到肾脏组织和功能的损伤均减弱。此类研究具有重要的临床价值。

肾脏替代治疗目前仍然是AKI的主要治疗手段[19]。但是此治疗并没有明显缩短AKI的病程，而强化治疗方案也并没有增加存活率和改善远期预后。从长远来看[20]，应用Klotho减少肾单位的损伤，促进肾脏恢复是治疗新思路。Klotho保护肾脏免受损伤的具体机制尚不得而知，而抗氧化、抗吞噬、促进血管增生在其中可能起到重要的作用。

除了AKI，还应该注意CKD患者Klotho的水平也减少。目前已经有不同的实验室采用不同的实验动物模型，均得到了相同的Klotho保护肾功能的结论。通过病毒导入Klotho基因的动物，更好维持肾脏的功能，减少尿蛋白，而且降低了血管紧张素Ⅱ对肾小管间质的改变[21]。在免疫相关的肾小球肾炎中，通过病毒导入Klotho基因，使之高表达，能够抵御氧化应激，减少肾脏损伤，提高患者的生存率。还有研究发现，在自发性高血压大鼠中，通过病毒导入高表达Klotho基因，有降低血压，改善肾脏组织，抑制氧化的作用。

采用CKD大鼠制备单侧肾脏切除加对侧肾脏缺血再灌注损伤模型，结果Kl+/-CKD大鼠存在高血压、贫血、肌酐清除率下降、蛋白尿、严重的肾间质纤维化和肾小球硬化。相反，在Tg-KlCKD大鼠中，所有的改变均有不同程度的减弱[22]。所以，通过这个试验，可以认为Klotho在动物中为肾脏保护因子。

4 Klotho对机体软组织的钙化调节

低钙血症和移位钙化在CKD患者中比较常见，且多为高磷血症导致。比如甲状旁腺功能亢进、骨矿物质钙化不良、心血管钙化等。调节血磷水平可以有效改善所有这些病变。CKD相关的血管钙化在Kl-/-和WT小鼠中表现明显，但是在Tg-Kl小鼠中，这些病理变化均消失。表明Klotho能够阻止异位钙化的发生[23]。Klotho具有调节血管内皮细胞功能和松弛脉管系统的作用。

在Kl-/-和WT小鼠各个器官中均有严重的钙化，而在Tg-Kl小鼠模型中钙化非常少甚至没有。同时还观察到，在WT小鼠中甲状旁腺激素水平高，在Tg-Kl小鼠中则相对较低。相对稳定的Klotho水平能够减少周围软组织的钙化。

血管钙化的另一个决定性因素为血清磷的浓度。Kl-/-和WT小鼠的血清中均含有较高浓度的磷，而相反在Tg-Kl小鼠中却很少有表现为高磷血症。既然Klotho为重要的血磷调节剂，那么另外一个可能机制是，其可能是通过增加尿中磷的排出量，降低血磷浓度来减少软组织钙化。

对于血清磷和血肌酐相同的条件下， Tg-Kl小鼠软组织钙化的程度最轻，Kl-/-小鼠的钙化程度最重，而WT小鼠居中。仅仅通过不同的Klotho的浓度来确定异位钙化的严重程度是不足的，血清磷和血肌酐水平一样也起到了重要的作用。这种现象说明，Klotho可以直接保护软组织对抗钙化，且这种作用不依赖肾脏对尿磷的调节和其对肾小球滤过率的保护性作用。那么，Klotho作用于脉管系统的机制是什么？

Na-Pi联合转运蛋白(主要包括Pit1和Pit2)是血磷流入脉管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的主要载体，且是血管钙化的主要元凶。正向调节剂Runx2(成骨细胞标志物)，负向调节剂SM22(平滑肌细胞的收缩标志物)在血管钙化中均能监测到。在Kl-/-小鼠动物模型中，Pit1、Pit2和Runx2表达增加而SM22表达减少。相反，Klotho过度表达的结果相反[23-24]。Klotho可能控制着平滑肌细胞的分化和去分化。在Klotho减少时，CKD表现为相同的表型，CKD的所导致的各种症状可以被Klotho阻断。体内实验的一个缺点是，不能提供Klotho直接作用于磷转运蛋白和血管平滑肌细胞分化的机制。

在体外生长的血管平滑肌细胞中，Klotho能够作用于Na-Pi联合蛋白阻止磷的转入，减低高血磷导致的矿化作用。重组的Klotho能够逆转高磷所致的高表达的Runx2和低表达的SM22，表明Klotho能够直接阻止磷所导致的去分化。数据表明,Klotho能够通过3种机制发挥作用：增加尿磷排泄、保护肾功能、直接作用于血管平滑肌细胞[25-26]。

5 总 结

总之，肾功能损伤、修复与Klotho有着重要的关系。AKI可以伴随Klotho的减少，而CKD也存在Klotho缺乏。Klotho不仅仅是肾脏疾病的蛋白标志物，而且其急剧减少打乱了CKD患者的矿物质代谢和血管钙化平衡。在AKI和CKD中早期应用外源性Klotho蛋白能够提高肾功能的恢复，提高患者的生存率。Klotho在肾脏病中至少起到两重作用，(1)可以作为肾脏疾病早期敏感的生物学标志物。(2)应用外源性Klotho能够通过减少损伤和促进恢复起到治疗作用。而对于CKD则可以减缓肾脏病的进展和减少并发症。

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赵洪刚(1973-)，硕士，副主任医师，主要从事影像医学及核医学方面的研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.047

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