微小RNA在食管鳞癌化疗耐药性中的研究现状

胡 智,刘 单 综述，戴天阳 审校

(1.泸州医学院附属医院胸心外科 646000；2.泸州医学院 646000)

·综 述·

微小RNA在食管鳞癌化疗耐药性中的研究现状

胡 智1,刘 单2综述，戴天阳1审校

(1.泸州医学院附属医院胸心外科 646000；2.泸州医学院 646000)

微小RNA；食管鳞癌；化疗耐药

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国常见的消化道恶性肿瘤之一；化疗及新辅助化疗是ESCC非手术治疗的重要手段，但后期肿瘤耐药性的产生是临床面临的难题。近年来表观遗传学领域研究显示：微小RNA(miRNAs)是非编码单链RNA，在肿瘤细胞增殖、转移、凋亡等过程中扮演着重要角色；通过筛查肿瘤耐药产生过程中miRNAs的变化，寻找相应的靶蛋白及信号通路，将为逆转耐药性，增加化疗药物敏感性提供帮助。

1 miRNAs的生物角色

miRNAs是新发现的一类高度进化、保守、非编码的长度为19～25个核苷酸的非编码单链RNA。相关实验研究认为,miRNAs在RNA诱导沉默复合物作用下与互补mRNAs结合,降解靶mRNAs或阻止其转录后翻译。人类基因组中有约30%的编码蛋白基因受其调控,miRNAs在调控发育、分化、增殖及凋亡等基本的生命活动中扮演着重要角色。近年来研究认为，miRNAs调控基因表达存在复杂的组合模式。miRNAs作为人类基因组中最大的一类调控因子，参与人类约1/3的编码蛋白基因的调控。研究表明，miRNAs可通过肿瘤细胞的关键调控靶标而发挥基因转录后调控的作用，影响疾病的发生发展过程。miRNAs与ESCC的关系是在2008年由Guo等[1]首次报道：他们采用miRNAs微阵列技术发现hsa-miR-25,hsa-miR-424，hsa-miR-151在ESCC手术标本中较癌旁组织明显上调。

2 肿瘤化疗耐药

无论是对晚期癌症患者术前诱导缓解还是手术切除后巩固，肿瘤化疗仍是目前提高ESCC患者生存期和生活质量的主要手段，然而，肿瘤细胞化疗耐药性的产生是临床上影响患者疗效、预后的障碍[2-3]。根据肿瘤的耐药谱可分为原药耐药和多药耐药(multidrug resistance，MDR)。目前更多的是MDR，更换化疗方案或采取联合化疗的方案可能收益甚微，且带来较多的药物不良反应，最终导致化疗失败。

肿瘤耐药机制包括药物吸收降低或排出增多、药物靶点改变、细胞修复功能增强及细胞凋亡减弱等,涉及药物作用各个环节关键基因突变可能导致耐药发生。肿瘤化疗耐药的主要分子机制是：(1)通过改变控制凋亡相关蛋白质的平衡来降低化疗敏感性，如p53基因的突变、PTEN基因突变、Bcl-2基因突变、凋亡配体的表达。(2)与药物转运相关蛋白表达增强，如P-糖蛋白 (P-gp),来源于多药耐药相关蛋白和乳腺癌耐药蛋白。(3)肿瘤细胞损伤后DNA自我修复能力增强，如DNA拓扑异构酶、烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶AGT、核酸切除修复增强以及错配修复缺陷。

因此，克服甚至逆转ESCC的多药耐药是亟须解决的难题之一，为此，近年来许多科学家试图从遗传学及表观遗传学的分子途径寻求突破。在所有病例中寻找更好的方法来界定耐药，是为克服ESCC耐药提供可行方案的关键步骤[3]。

3 miRNAs与肿瘤化疗耐药

大量实验和临床研究表明，肿瘤耐药细胞中存在miRNA表达异常，其异常往往导致肿瘤耐药。miRNAs为一类高度保守的非编码RNAs,通过对各环节关键基因表达的调控进而调节食管癌细胞对化疗药物的敏感性，但其涉及过程十分复杂：肿瘤细胞miRNAs突变或表达异常,导致miRNAs对靶基因如药物转运相关基因、细胞损伤后自我修复能力相关基因、细胞凋亡相关基因及肿瘤上皮间质化相关基因等表达的异常调控,导致肿瘤细胞化疗耐药产生。同时,根据这些miRNAs表达情况可预测肿瘤患者对药物的反应[4]。

3.1 miRNAs基因多态性与ESCC耐药 miRNA基因多态性包括影响 miRNAs正常功能的各种基因多态性。在人类基因组中导致miRNAs功能增强或减弱的各种突变可分为影响miRNAs生物合成的基因突变、miRNAs靶基因的突变以及影响 miRNAs基因正常的表观遗传学调节。Wu等[5]通过对5个基因位点单核苷酸基因多态性(miR-146a rs2910164,miR-196a2 rs11614913,miR-100 rs1834306,miR-125a rs12976445 和 miR-26a1 rs7372209)进行分析，发现miR-146a rs2910164与血液毒性有关,miR-196a2 rs11614913和miR-125a rs12976445与生存率有关，miRNAs基因多态性可预测以铂类为基础的ESCC化疗药物的疗效。

3.2 miRNAs异常表达与ESCC耐药 Hummel等[6]在研究新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy,NACT)与食管癌细胞miRNAs的表达关系时发现，选用顺铂(cisplatin，CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-fludrouracil，5-flu)对ESCC处理24 h或72 h之后，抽取RNA作基因芯片研究发现：ESCC在短期或长期暴露后表达miRNAs呈现类似的变化，13个miRNAs在作用24、72 h后(miR-199a-5p,miR-302f,miR-320a,miR-342-3p,miR-425,miR-455-3p,miR-486-3p,miR-519c-5p,miR-548d-5p,miR-617,miR-758,miR-766,miR-1286)的表达均上调。miRNAs网络预测功能显示：miRNAs的靶分子通路与化疗后生存时间密切相关，涉及细胞增殖、凋亡过程，DNA复制、重组和修复过程以及药物代谢的过程。

3.2.1 miRNAs过表达与ESCC耐药 为了确定miRNAs在食管癌中的表达与患者化疗耐药机制之间的关系，Hamano等[7]收集接受术前化疗的食管癌手术患者的标本，选取几种被认为是参与调节干细胞功能的miRNAs(let-7a、 let-7g、miR-21、miR-134、 miR-145、miR-155、miR-200c 、miR-203和miR-296)，并分别进行实时逆转录PCR检测，结果显示：在顺铂耐药的ESCC中，miR-200c表达显著增加，通过转染抑制miR-200c细胞，其对顺铂敏感性和细胞凋亡率明显增加；而敲除miR-200c表达将会使蛋白磷酸酶2A的一个亚基(PPP2R1B)含量上升，后者会导致Akt信号通路的激活。

3.2.2 miRNAs低表达与ESCC耐药 miRNAs并非都是一致性影响化疗耐药，Hummel等[4]培育了对CDDP、5-flu耐药的ESCC发现：70%的细胞株miR-148a上调显著增加CDDP敏感性，表现为：CDDP作用后细胞活力减少22.6%±7.9%至50.5%±10.6%，5-flu作用后细胞活力减少6.0%±0.8%至15.0%±4.1%，上述过程可能与CDC25B、Bcl-2相关。但5-flu耐药ESCC细胞株暴露于5-flu没有相应的作用。Mayne等[8]认为，术前对食管癌患者的诱导放化疗所取得的临床效果的差异性，与患者体内miRNAs的表达差异有关，他通过对大量临床样本的筛查，发现miR-135b、miR-145在癌组织中的表达减少，提高了诱导放化疗后无瘤生存期。

3.3 miRNA调控ESCC耐药的分子机制

3.3.1 miRNAs调控细胞凋亡相关基因表达 (1)p53基因是重要的抑癌基因，化疗使肿瘤细胞DNA损伤，其损伤过程将启动 p53基因促使细胞进入G1期，进而抑制其生长并诱导凋亡；若 p53基因表达异常会影响该凋亡过程，使细胞对化疗不敏感。Yuan等[9]认为：睾丸特异性基因10(testis specific 10，TSGA10)具有与miR-577相同的结合位点，miR-577/TSGA10轴将影响ESCC的G1～S期过渡，miR-577/TSGA10轴激活总是伴随着p53通路或RB通路失活。(2) PTEN基因亦具有强大的抑癌作用，通过抑制PI3K-Akt信号通路的激活介导细胞凋亡。Li等[10]证实：敲除miR-21显著增加PTEN蛋白的表达，增强ESCC在化疗中的细胞敏感性。(3)肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)广泛存在于食管癌中，同时也存在于正常细胞，为了提高TRAIL作用的特异性，Zhou等[11]利用由腺病毒组装的miR-143、miR-122应答元件(Ad-TRAIL-143-122)去限制在ESCC中TRAIL表达的调控，提高了化疗的疗效。

3.3.2 miRNAs调控药物外排作用相关的蛋白 P-gP是一种相对分子质量为170×103的跨膜糖蛋白(P170)，具备能量依赖性“药泵”功能：P-gP能将细胞内药物泵出细胞外，减低了细胞内的药物浓度使细胞产生耐药性。Zhou等[12]对104例食管癌及癌旁组织进行实时定量PCR分析，发现在ESCC中miR-483和miR-214的表达明显上调，与总体生存期呈负相关；术后化疗临床观察显示：二者的高表达可能预测化疗效果不佳。miR-483和miR-214下调可以赋予P-gP相关药物对食管癌细胞的敏感性，将增加细胞内个阿霉素(ADR)积累和减少ADR释放指数，表明miR-483和miR-214可能直接或间接影响细胞内药物的泵出。另外，下调miR-296[13]、miR-27a[14]可以增加ADR的细胞浓度，同时促进ADR介导的ESCC凋亡；另外还可以明显减少P-gP、Bcl-2的表达以及MDR1的转录。

3.3.3 miRNAs调控细胞损伤后自我修复能力相关基因表达 聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶1〔poly(ADP-ribose)pdymerase-1,PARP1)是存在于食管上皮的基因，在外界损伤刺激下，PARP1易被受损的DNA激活，进而引起细胞炎性反应甚至凋亡。Seki[15]认为在ESCC中miR-141通过YAP1(DNA损伤修复的重要基因)表达调控顺铂化疗耐药性；Imanaka等[16]通过实验证明：miR-141在顺铂耐药ESCC株中高表达，它通过调控YAP1 3′-非编码区降低其表达从而调节顺铂耐药性。

3.3.4 miRNAs调控肿瘤上皮间质化(epithelial-mesenchymal trnasition,EMT)相关基因表达 EMT在胚胎发育、创伤修复与组织再生、上皮来源肿瘤转移与侵袭过程和耐药中均发挥着重要作用。Zhang等[17]在 EC9706细胞株中发现：上调的miR-21可以促进EMT依赖因子——转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)表达。Yokobori等[18]将 TE-8种植到小鼠上发现，miR-150可以通过降解EMT诱导因子ZEB1降低其致瘤性。

3.4 miRNAs预测ESCC对药物的疗效 无论是术前辅助还是术后化疗，早期患者对抗肿瘤药物的敏感性高，但是随着治疗时间的延长患者对抗肿瘤药物产生了耐受性。因而寻找可预测的生物标志辅助临床实验方案，以达到在筛选食管癌患者进行确切、对症的药物治疗；近年来研究发现，miRNAs在食管癌的侵袭、分化、术后生存期等方面扮演了重要角色[19]。Tanaka等[20]认为：miR-200c水平预测化疗反应和行食管癌NACT患者的预后，miR-200c的高表达与无进展生存期缩短有关，多变量分析确定miR200c表达水平是接受NACT食管癌患者最有价值的预后因子。Odenthal等[21]对患者接受NACT后进行手术切除和病理学评价，同时从治疗前ESCC组织中和相应的手术标本中分离miRNAs，通过对NACT前后768个miRNAs分析发现：接受NACT后miR-192、miR-194和miR-622明显下调，更重要的是接受NACT之前miR-192和miR-194与联合治疗后的病理评价相关，可作为参照指标。Motoori等[22]选取25例铂类为基础的ESCC NACT患者，利用寡核苷酸微阵列探针对其内镜活检标本进行综合基因表达谱(comprehensive gene expression profiling，GEP)基因采样，然后利用CT扫描患者肿瘤区变化，肿瘤区面积通过NACT后减少大于50%为有效，反之小于或等于50%为无效。Motoori等构建了包含199个基因的基因表达谱用于预测、筛选食管癌NACT对象，其准确率达到了82%。Sugimura等[23]认为可以将let7用来预测以顺铂为基础的化疗效果指标，同时let7通过调控IL-6/STAT3通路调节顺铂药物敏感性。

4 总 结

近年来随着研究的深入，越来越多的miRNAs及其相关通路在ESCC化疗中的作用得到揭示，然而，以miRNAs为基础调控化疗效用还有不足之处，需要解决如：如何筛选特异性的miRNAs并构建miRNAs载体；如何减少载体植入后的排异及毒性反应等问题。另外，耐药性涉及多种因素，而miRNAs作为上游调控位点具备多靶位综合调控，如何与化疗药物联合，针对不同耐药途径中主要通路及相关基因、蛋白的表达来增强药物的敏感性，从而实现对临床个体化治疗策略，有待进一步研究。

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:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.041

泸州市科技局科技创新苗子项目[2013-R-51(9/18)]。

胡智(1985-)，硕士，住院医师，主要从事胸部肿瘤基础及临床研究。

R655.4

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1671-8348(2015)15-2124-03

2014-09-28

2015-02-18)