马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法

罗燕娜，刘江娜，王 航

（兵团第六师农业科学研究所，新疆 五家渠 831300）

马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法

罗燕娜，刘江娜，王 航

（兵团第六师农业科学研究所，新疆 五家渠 831300）

本文对北疆地区马铃薯主要病毒的特性和致病症状进行了描述，并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。

马铃薯；病毒；检测方法

马铃薯在我国广泛种植，已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。由于光照强、昼夜温差大、气候冷凉等优势，新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯，现种植面积已达2 310 hm2[1]。然而在当前的马铃薯生产中，病毒病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题[2]。目前，已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病毒1种，其中，侵染乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病毒为PSTVd。主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯 Y病毒 （PVY）、马铃薯 S病毒（PVS）、马铃薯M病毒 （PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）[1]。

1 马铃薯主要病毒种类及致病症状

1.1 马铃薯X病毒（PVX）

X病毒又称普通花叶病毒，病毒粒子为长杆状，大小为515 nm×13 nm，基因组全长6.4 kb[3]。该病毒可通过叶片汁液摩擦传播，也可通过蚜虫以非持久性方式传播，还可通过种薯传播[1]。感病植株症状多种多样，因栽培品种的敏感性不同和病毒株系的不同而存在差异，多数表现为轻花叶或潜隐症状，症状严重的则表现为严重的花叶或皱缩，产量损失可达50%。

1.2 马铃薯Y病毒（PVY）

Y病毒又称为重花叶病毒，病毒粒子形状为弯曲的线形，大小为750 nm×11 nm，多数通过桃蚜和大戟长管蚜传播。PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组 （PVYO）、马铃薯点条斑株系（PVYC）和马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN）。前2个株系组引起的主要初期症状是叶片坏死、斑驳，后期则表现为矮化、皱缩、斑驳和卷曲；第3个株系组初期表现为不同程度的花叶，后期为花叶和斑驳，当温度低于10℃或高于25℃时，花叶症状消失。产量损失最高可达80%。通常该病毒不会引起块茎发病，但近年来欧洲出现的一个新株系PVYNTN，则可在块茎上导致坏死环斑[4]。

1.3 马铃薯A病毒（PVA）

A病毒又称为轻花叶病毒，病毒粒体为弯曲的线形，大小为730 nm×15 nm，基因组全长9.7 kb。该病毒可通过汁液摩擦传播或由蚜虫以非持久性方式传播，也可通过种薯传播。感病植株的症状表现为脉间花叶、叶片有光泽、叶脉深陷和叶边缘粗缩，产量损失可达40%。

1.4 马铃薯S病毒（PVS）

S病毒又称为潜隐性花叶病毒，病毒粒子形状为线形，大小为650 nm×12 nm，病毒基因组全长7.4 kb。可通过汁液摩擦传播，也可通过蚜虫传播。感病植株初期症状不明显，严重危害时，叶片呈青铜色，叶脉轻微下陷，植株的开张度较大。一些品种上会出现坏死斑和条纹。在田间常与其他病毒混合侵染，当与PVX或PVM病毒混合侵染时，可减产20%～30%[5]。

1.5 马铃薯M病毒（PVM）

M病毒也属于香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）。病毒粒子为线形，大小为650 nm×12 nm，该属病毒基因组全长8.5 kb。可通过机械传播，或者通过蚜虫以非持久性方式传播，也可通过种薯的调运远距离传播。感病植株叶上表面的叶脉深陷，有的出现粗缩，叶片轻微下垂，顶部叶片呈开散状。

1.6 马铃薯卷叶病毒（PLRV）

PLRV属于马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），病毒粒子为六边形等轴对称，直径24 nm～26 nm，基因组全长5.9 kb。主要由蚜虫传播，也可通过种薯传播。感病植株发病较轻时表现为幼叶褪绿、卷曲，叶基常有紫红色边缘。发病较重时，植株矮化，叶片上卷并革质化，产量损失可达70%[1]。

2 马铃薯病毒检测方法

因马铃薯茎尖脱毒培养过程中各环节都会有误差，所以在茎尖苗扩繁之前必须对马铃薯苗进行严格的病毒学检测，确定不带病毒后才能进一步扩繁。除此之外，还必须抽样检查以下几种情况：瓶苗下地之前、组培苗扦插结束、试管薯出苗后30～40 d、现蕾期至盛花期、收获前30 d左右、收获后和种薯出库前。因此，在马铃薯脱毒种薯培育过程中，准确可靠的病毒检测方法与高效的脱毒方法同等重要[6]。

目前，北疆地区常用的马铃薯病毒检测方法是酶联免疫吸附法（双抗体夹心法（DAS-ELISA））。该检测方法的主要操作过程有以下几步。

2.1 准备工作

实验前，在设计图表上注明各反应孔的位置，以避免出错。在密封塑料盒底部铺1张吸水纸，倒入适量蒸馏水使之刚好润湿，即为恒湿箱，孵育用。微孔板为可拆卸，根据用量取出所需数量的微孔，未使用完的微孔密封好，4℃下保存。

2.2 样品的提取及稀释

尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验。使用通用样品提取缓冲液来碾磨稀释样品。若用研钵提取样品，在每份样品提取后彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染。

将样品与通用样品提取缓冲液以1∶10（样品重量（g）∶提取缓冲液体积（mL）的比例研磨样品。

每个反应孔需要100 μL的样品提取稀释液。多制备一些样品提取稀释液以利于吸取。

2.3 点样

根据实验设计，取100 μL样品提取稀释液到各样品孔中，取100 μL阴性质控物溶液到阴性对照孔中，取100 μL阳性质控物溶液到阳性对照孔中。

2.4 准备酶标结合物

检测抗体和酶标抗体均为浓缩液体，应根据标签上的稀释倍数用ECM缓冲液稀释。根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物和检测抗体（瓶A和瓶B）加到1倍的ECM缓冲液中，混合均匀。1 μL的检测抗体稀释液可供8个反应孔使用，10 μL的酶标记物稀释液可供96个反应孔使用。

2.5 洗板

孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，加入250 μL的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复7次，将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。

2.6 加酶标结合物

在各反应孔中加入100 μL配置好的酶标结合物溶液。

2.7 孵育

室温下（25℃）在恒湿箱中孵育2 h。

2.8 PNP底物的制备

孵育结束前15 min制备PNP底物溶液。在室温下用5 mL PNP缓冲液溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5 mL的底物溶液，溶解比例为1 mg/mL，可供40个反应孔使用。在室温下用5 mL PNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。

2.9 洗板、加PNP底物溶液

洗板步骤同2.5，重复8次。在各反应孔中加入100 μL PNP底物溶液。

2.10 孵育

在恒湿箱中孵育60 min，避免阳光直射或强光照射。

2.11 结果分析

直接用肉眼观察或用酶标仪在405 nm波长下测量结果。

阳性结果：微孔中有明显颜色变化；阴性结果：微孔中没有明显颜色变化。只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候，实验结果才是可靠的。结果可保持1 h左右（只要阴性质控孔不发生颜色变化）。

3 结语

建议种薯加工企业在3个环节上进行质量检验：（1）核心种苗必须进行病毒检测，检测方法可采用DAS-ELlSA。（2）田间检验。全部植株目测检查3次，目测不能确诊的非正常植株采集样本进行实验室检验，种薯每批次至少随机抽检5～10点，每点100株，各指标可参照GB18133-2012标准[7]。（3）块茎检验包括收获后检测和库房检验，原原种每个品种每100万粒检测200粒，大田每批种薯根据生产面积确定检测样品数量，种薯出库前应进行库房检查，抽样及检验样品数量参照GB18133-2012标准，并采用目测法检测窖藏病害及混杂等情况。

目前，应用于马铃薯病毒的免疫学检测技术以ELISA技术最成熟，应用最广泛。多年来，这项技术被不断改进和创新，现已形成直接酶联检测法、间接酶联检测法 （I-ELISA）、双抗体夹心法 （DASELISA）、三抗体夹心法（TAS-ELISA）等多种检测方法[8]。双抗体夹心法（DAS-ELISA）与其他检测方法相比较，有突出的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达l～10 ng/mL；二是快速，几个小时内即可出结果；三是专化性强，重复性好；四是检测对象广，粗汁液或提纯液都可检测，一般不受抗原形态的影响，无论是完整的还是降解的病毒粒体都可检测；五是可处理大批样品，适合种薯生产中大量样品的多种马铃薯病毒的快速检测。但也存在一些缺点：检测病毒时会出现假阳性反应，准确性降低；病毒浓度低，当年不显症时无法检测；无法检测类病毒。

[1]董代幸.乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究[D].新疆农业大学，2010.

[2]李济宸，唐玉华，谭宗九，等.马铃薯病害及其防治[M].石家庄：河北科学技术出版社，1992.

[3]王春香，高谦，潘乃穟，等.马铃薯X病毒外壳蛋白基因的cDNA克隆和全序列测定[J].植物学报，l991，33（5）：363-369.

[4]李入贤，张文龙，施文娟.马铃薯脱毒种薯（苗）病毒检测技术研究进展[J].种子，2009，28（4）：60-62.

[5]吴兴泉，吴祖建，谢联辉，等.马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达[J].中国病毒学，2002，17（3）：248-251.

[6]聂峰杰，张丽，宋玉霞，等.宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测技术的现状和发展途径[J].中国种业，2014（7）：17-21.

[7]王怀栋，黄修梅，李明.浅谈马铃薯脱毒种薯质量控制[J].黑龙江农业科学，2012（3）：116-119.

[8]毛彦芝.马铃薯病毒检测技术的研究概况 [J].中国蔬菜，2009（12）：1-6.

兵团重点水利工程获中央投资逾13亿元

2015年，国家加大对兵团重点水利工程中央投资力度，拟安排兵团大型灌区节水改造中央投资11.6亿元，较2014年增长132%；节水增效示范工程拟安排中央投资1.5亿元，较2014年增长130%。中央投资达到13.1亿元，增速再创历史新高。

兵团14个师的170多个农牧团场主要分布在塔克拉玛干和古尔班通古特两大沙漠边缘以及2 000多公里的边境线上，所处区域自然禀赋差，水资源总体比较缺乏，进行各类水利工程建设是团场发展的重要保障。

近年，兵团已实施肯斯瓦特水利枢纽工程、叶尔羌河流域灌区水资源开发等一大批水利建设项目。2015年，兵团将重点实施二师三十八团水源工程、叶尔羌河中游渠首三师前海总干渠配套工程等建设项目，并继续支持中小河流治理、引额灌区工程、奎屯河引水改扩建、节水增效示范等重点水利工程建设。目前，叶尔羌河中游渠首三师前海总干渠配套工程已全面启动实施，工程完成后，将惠及图木舒克市、巴楚县三乡二镇等近40万人，满足灌区9.5万公顷耕地、林地用水需求，增强灌区抵御旱灾、保持稳产高产的能力。

（《兵团日报》）

2015—01—20