结合雌激素纯化及组分分析研究进展

左晓佳，郑文新，托乎提·阿及德，毛琼玲，肖海霞

（1.新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆 乌鲁木齐 830000 2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

结合雌激素纯化及组分分析研究进展

左晓佳1，郑文新1，托乎提·阿及德2，毛琼玲1，肖海霞2

（1.新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆 乌鲁木齐 830000 2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，新疆 乌鲁木齐 830000）

从孕期马尿中提取出的雌激素代谢产物称为结合雌激素，临床上可用于治疗多种雌激素缺乏所导致的更年期症状。近一个世纪对其的研究取得了较多成果，本文对其分离纯化方法，组分及化学结构分析的研究进展进行了综述，并对该领域有待进一步深入研究的方面做了展望。

结合雌激素；孕马尿；分离纯化；组分鉴定；

结合雌激素（conjugated estrogen hormone;conjugated estrogens，简称CE;）是对最早从孕马尿中提取的，多种天然固醇类水溶性结合态雌激素混合物的统称。经过多年对激素代谢的研究发现，雌激素在哺乳动物体内是以胆固醇为起始物，经孕醇酮，雄烯二酮，睾酮等多种中间产物，最终形成雌二醇[1]。在体内代谢过程中，经过多种酶的作用经过羟基化、羟基脱氢氧化、羟基硫酸酯化等一系列中间反应形成多种中间产物参与动物体内不同的生理反应，最终以葡萄糖苷酸，硫酸盐的结合形式随尿液排出体外。经过近八十年的研究结果证实尿液中所含的结合雌激素中的确成分复杂，几乎包含雌激素代谢过程中所有的中间产物。

早在上个世纪30年代左右，有学者发现怀孕的妇女尿液中存在大量的雌激素成分并作了进一步提取，接着Zonedek等人又在孕马尿中发现大量的水溶性结合态雌激素，引起了很多学者的关注并在此后多年致力于分离纯化云马尿中的结合雌激素的工作，终于在1938年Schacter和Marian首次采用萃取法成功从孕马尿中分离出了雌酮硫酸盐[2]。随后的几年针对结合雌激素的应用开发、药效分析研究一直是学者关注的重点，终于在1942年FDA首次通过了美国惠氏-艾尔斯特制药公司生产的结合雌激素药品倍美力（Premarine）的正式使用，认为该药对更年期综合症及相关症状安全有效。随着近现代精密的分析鉴定仪器的开发，促进了人们对未知成分的结构分析鉴定手段的进步，近代更多的研究则主要集中于结合雌激素分离方法优化，组分及化学结构分析研究。

1 结合雌激素分离纯化方法研究进展

雌激素代谢的所有中间体和最终产物几乎都是甾体化合物，并且以硫酸盐的形式存在于孕马尿中，利用其特殊结构及其物理化学性质，从上个世纪30年代开始随着现代化的分离技术进步，学者们开发了多种结合雌激素纯化的方法，分离效果、回收率也在不断提高，主要有以下几种方法。

1.1 萃取法及沉淀法

早期开展纯化工作，由于实验器械简单，对结合雌激素类物质的物理化学性质了解有限，大部分采用的是沉淀法和萃取法。

通过在原料混合物中加入某些试剂和结合雌激素发生反应形成沉淀或使其在溶剂中溶解度大幅下降，来分离获得有效成分的方法是沉淀法。Russell，Murker等人在1938年采用经典的沉淀结晶法从孕马尿中分离出了孕二醇、孕二酮等结合雌激素有效成分。

利用雌激素代谢物在互不相溶的溶剂中分配系数的不同的性质开发出了萃取法，这也是早期研究的最多的分离结合雌激素的方法。Schacter和Marian首次从孕马尿中分离出了雌酮硫酸盐就是采用的该方法。由于萃取操作简便，成本低廉，一直作为初级分离的首选方法。几十年间不乏有专利和文献报道了采用该方法进行分离。最近的采用该方式纯化的是Gerling Klaus-Guenter和Ban Ivan等[3]公布的一个专利US8815299，仍然采用的是液-液萃取法，采用乙酸酯、乙醚、二氯甲烷、甲基叔丁醚组成的一组溶剂采用液-液萃取法，富集孕驴尿中的结合雌激素，并且利用了现代化的萃取仪器提高回收率，同时去除黄酮类非结合态甾体类化合物。

早期萃取设备简易，液-液萃取时，容易造成乳化现象，导致分离提取效率低、周期长，并且有机试剂用量高，严重的污染环境，并且造成成本难以下降。在柱层析技术出现后，已经较少的用于结合雌激素的分离。

1.2 柱分离法

几十年里，人们对于结合雌激素主要组分结构了解越来越多，其特殊的化学性质也被一一解析，柱层析法就是利用结合雌激素类物质特殊的官能团，主要选取非极性或中极性大孔吸附树脂或离子交换树脂做填料，有选择性的高效分离结合雌激素混合物。随着新型高分子材料开发的进步，利用其作为填料开发新的纯化方法是近几十年里研究该方面的主要手段，目前已有很多相关专利公开。

1968年H.Leon Bradlow等人利用甾体结构物质的疏水性，采用一种苯乙烯-二乙烯聚合物非极性树脂，成功的从孕马尿中分离出了结合雌激素，然而其吸附能力较低，产物中含有10%的尿液固体。1973年Thompson L等人又采用了一种含有季铵官能团的强碱性阴离子交换树脂Dowex 1-X2-C1提取出了结合雌激素。两千年前后，国内外陆续有多个相关的发明专利被公开，他们大多数都是采用的大孔树脂柱分离法，例如1998年Ivan Ban等人美国专利US5814624中使用反相硅胶，通过相当复杂的前处理获得了结合雌激素[4]；2002年台湾神隆公司宋瓦拉帕和王静仪[5]等人在专利CN1381240A公开了利用非离子大孔树脂从孕马尿中获得结合雌激素的粗提物的方法。2005年Lomans等人的美国专利US6855704公开了一种使用了三种非极性和中性的大孔树脂反复精提分离出孕马尿中不同的结合雌激素成分的方法[6]。2008年Rasche Heinz-Helmer和Rupp Olaf等人[7]在美国专利US7439235中公开了一种利用中性丙烯酸树脂提取孕马尿的方法，该方法的优势是可以从曾经保存不当的孕马尿中提取出高活性、高纯度的结合雌激素。2007年高晓黎，肖建民[8]在中国专利CN1803150A中通过改进H.Leon Bradlow等人的方法，通过几种简易的方法处理之后，用含有酯基结构的苯乙烯-二乙烯苯中性大孔吸附树脂分离孕马尿，吸附能力得到了有效的提高，增大了回收率，有效降低了成本，并且在2012年获得了美国专利号US8129363。2013年Lomans John和Leiva-paredes Carmen[9]在美国专利US8349819中公布了一种可以在孕期哺乳动物尿液，特别是孕马尿中获取结合雌激素的方法，该方法利用聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、以及具有硫酸基团的苯乙烯-二乙烯苯树脂三种不同的树脂分别提取结合雌激素中各种结构的主要成分。

然而柱层析法分离结合雌激素也存在一定的缺陷，大孔树脂机械强度低，容易破碎，回收次数少，容易增加成本，另外药品生产对于树脂材料的选择比较严格，必须耐强酸碱，且安全无害，不能引入有害物质。马尿提取结合雌激素工艺开发仍面临许多挑战，需要随着新的技术和材料的开发不断调整。

2 结合雌激素组分的定性定量方法研究进展

结合雌激素成分复杂，在理论上，孕马尿中的结合激素应包含雌激素代谢过程中几乎所有的中间体，早期的研究发现也证实了这一点。目前发现其至少含有200中以上的成分，其中很多结构至今还不明确。早期的分析工作只能分离并分析出毫克级以上的组分，随着仪器分析的发展，目前主要利用气相-质谱、液相、薄层层析、放射免疫分析、光密度分析等[10]。

2.1 气相色谱法

气相色谱的发明使得许多易挥发易氧化的物质分离检测成为可能，结合雌激素是芳香族有机化合物，常温下见光或暴露在空气中都易使结构发生改变，在惰性气体环境下分离并检测无疑可以得到较准确的定性及定量结果。

Lyman Garw等人[11]在1982年就利用熔融硅胶毛细管气相色谱法检测出倍美力（Premarine）中的10种雌激素类成分。2001年，汪洁，胡建国等人[12]，将水解后的游离雌激素硅烷化处理后，用RtxR-255气相色谱柱检测出倍美力软膏中6种结合雌激素，其中雌酮、马烯雌酮、17α-马烯雌酮定量回收率均达到100%，RSD低于1.5%。

2.2 液相和液-质法

结合雌激素多从孕马尿中经柱层析方法提取，液相对溶剂的要求、检测条件的控制没有气-质严格，且不需要像气相检测一样需要做柱前衍生，更易于操作，同时芳香族化合物在紫外下有特征吸收，采用常规紫外检测器即可达到分离检测的目的，因此近些年来的定性定量工作多采用液相、液相串联一级质谱、液相串联二级质谱。

Gatti R[13]用HPLC-荧光测定孕马尿中马烯雌酮和马萘雌酮，采用ODS色谱柱，三乙胺磷酸盐为缓冲液，分离氯仿萃取后的孕马尿，在λex=280nm,λem=410nm和320 nm荧光检测到分离效果较好的马烯雌酮和马萘雌酮。John C.Reepmeyer等人[14]在2005年通过液相-电喷雾质谱法成功分离了结合雌激素中马烯雌酮和他的同分异构体Δ8,9-脱氢雌酮硫酸钠盐。Jerry Tso等人[15]在2010年利用液-质/质方法成功分离并定量了牛奶中的雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇以及他们的结构类似的代谢物硫酸盐，并且对于游离雌激素优化回收率到72%-117%，结合雌激素回收率达62%～112%。

2.3 其他方法

Morgan MRA等人在1980年发现了一种直接的、高精度的放射免疫分析发测定马烯雌酮的方法，该方法灵敏度高达50 pg/ml。然而该方法容易发生合成雌激素免疫原交叉反应，且对于检测设备条件要求较高，现在已很少使用。

Novakovic J等人[16]用光密度分析检测结合雌激素原料药及其制剂，酶水解出游离的雌酮、马烯雌酮等游离雌激素，用氯仿萃取之后，在薄层板上分离并在280nm下直接扫描定量分析。该方法简单、迅速且重复性较好。同时他们又采用荧光光密度分析法同样得到了很好的检测结果，基本与美国药典（USP21版）所述方法的检测结果一致。姚军高晓黎[17]等人在2011年也成功采用银化硅胶薄层层析法快速定性了新疆孕马尿中的雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠及17α-二氢马烯雌酮硫酸钠。

FDA早在1942年就批准了结合雌激素药品倍美力（Premarine）的正式使用，并在美国药典中主要严格控制雌酮硫酸钠，马烯雌酮硫酸钠，17α-17β-雌二醇硫酸钠，17α-二氢马烯雌酮硫酸钠，等10中结合雌激素成分。经过多年的研究，目前可以确定孕马尿提取出的结合雌激素中至少含有200种成分，每升约含量结合雌激素70-130mg，并随妊娠期阶段不同尿液各组分含量有一定差异。

3 发展与展望

目前马尿提纯结合雌激素工艺已日趋完善，随着分离技术的进步，其纯化工艺将向安全、有效、经济、有利于产业化的方向发展；结合雌激素中主要成分的结构已经确定，然而马属动物妊娠期不同时间段和不同种类、不同地域的马属动物其尿液中结合雌激素含量均不同，对其规律的探索有助于结合雌激素产业化研究和马属动物遗传学方面研究的开展；结合雌激素作为激素替代疗法被应用于多种更年期综合病症的治疗，然而其成分复杂，有效成分都是雌激素的代谢产物或中间产物，其药效是多种有效成分共同作用产生的，明确其有效成分在体内的调控机理对使用其治疗更多其他病症具有巨大意义。

马属动物的消化器官构造与代谢机能相似，理论上马属动物尿液均能分离出结合雌激素。我国驴种资源丰富，肉驴是传统畜牧业的一个重要组成部分，目前驴的饲养主要用于产皮、产肉、产奶，然而其尿液的利用研究却几乎是空白。驴对蛋白质的吸收略低于反刍动物，而高于马、骡子，其尿液中雌激素含量必定与其他马属动物有着较大差异，对其尿液中结合雌激素含量的研究必定对马属动物遗传学探索具有很大意义，且具有一定的产业化前景。

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Research Advance of Conjugated Estrogens Purification and Component Analysis

ZUO Xiao-jia1，ZHENG Wen-xin1，TUOHUTI·Aji-de2，MAO Qiong-ling1,Xiao Hai-xia2
（1.Livestock Husbandry Standardization Institute of Animal Science Academy, 2.Animal Science Institute of Animal Science Academy,Urumqi 830000,China）

Estrogen metabolites extracted from pregnant mare urine called conjugated estrogens,which has been used to treat menopause symptoms caused by estrogen deficiency.Many research results of conjugated estrogens have been obtained in the last century.In this article,the methods of separation and purification were summarized,and the structural analysis advances were was reviewed,and further in-depth study was prospected.

Conjugated estrogens;pregnantmare urine;separation and purification;Component identification

S821

：A

：1003－6377（2015）05－0001-05

农业部财政项目“中国马驴品种资源评价”（农财2009）

张莉（1975-），女，副研究员，博士 ，主要从事肉羊遗传育种 、资源保护和行业发展动态等研究。E-mial：zhangli@263.net

杜立新（1956-），男，教授，主要从事肉羊分子遗传育种、畜禽遗传资源保护 、养羊生产等方面的研究 。

2015-06-20，

2015-07-08