蛋白质二硫键异构酶参与血栓形成的研究进展

秦冉冉 综述 王志浩 审校

(山东大学齐鲁医院老年医学科，山东 济南 250012)

近年来，血栓性疾病因其高发病率、高危害性及治疗的高花费越来越受到人们的重视，相关疾病遍布临床各个科室，是临床上比较棘手的问题之一。现有的抗血小板、抗凝药物在心脑血管血栓性疾病的一级预防中不良反应较多［1-2］。因此，寻找调控血栓形成的新物质成为血栓治疗的新方向。进一步阐明血栓形成的复杂机制对于血栓形成性疾病的预防和治疗，提高心脑血管疾病患者的生存质量和时间具有重要意义。近年来，人们逐渐认识到血小板活化和凝血因子的激活存在一个共同的规律，即参与其过程的主要的功能性蛋白的活化大多受变构二硫键的控制，而这些变构二硫键受蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)的调控［3］。因此PDI 在血栓形成的研究中成为热点，也为血栓疾病的治疗提供了新思路。

1 血栓形成的经典理论

目前已知，血栓的形成有两个关键环节:血小板活化和凝血系统激活。

1.1 血小板的活化

在人体内，血管受损后，内皮下胶原暴露，从而触发血小板与内皮胶原的黏附。血小板膜上有多种胶原蛋白受体，血小板的激活包括蛋白水解、蛋白质和蛋白质、蛋白质和配体蛋白质的相互作用，是一系列复杂的过程，至今还未完全阐明。对于这一过程的简要总结就是受损的内皮细胞将导致胶原蛋白暴露从而让糖蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)吸引血小板。血小板单层排列，轮流为更多的血小板聚集引起一系列瀑布反应产生更多的凝血酶［4］。血小板也开始分泌其他活性物质来绑定血小板受体和增加细胞内钙含量。这将导致血小板受体结合纤维蛋白原从而增加血小板的黏附和血栓的形成。许多与血小板激活有关的整合素受体包括血小板膜糖蛋白Ⅰb(glycoproteinⅠb，GPⅠb)、糖蛋白Ⅵ(glycoproteinⅥ，GPⅥ)、糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(glycoproteinⅡb/Ⅲa，GPⅡb/Ⅲa)即αⅡbβ3整合素和α2β1整合素等含有丰富的半胱氨酸亚单位，可能允许PDI 调节硫醇的氧化还原状态［5］。

1.2 凝血系统的激活

众所周知，凝血系统的激活包括两条途径:内源性凝血途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径是指参与凝血的因子全部来自血液，通常因血液与带负电荷的异物(如胶原等)表面接触而启动，其过程是:由Ⅻ因子被激活形成Ⅺa-Ⅷa-Ca-PL 复合物并激活Ⅹ因子。外源性凝血途径是指由来自于血液之外的组织因子(tissue factor，TF)暴露于血液而启动的凝血过程，又称TF 途径。其过程则是指从TF 被释放到TF-Ⅶa-Ca 复合物形成并激活因子Ⅹ的过程。二者共同通路是指因子Ⅹa 形成后，两条途径合二为一，激活凝血酶原并最终生成纤维蛋白的过程。目前普遍认为，外源性凝血途径对动静脉凝血过程的启动有着非常重要的作用，而内源性途径只对凝血过程起一个放大和维持的作用。在生理条件下，TF 在细胞表达，不暴露于循环中。在病理条件下TF 可能会暴露于内皮细胞和单核细胞，启动血栓相关事件，如动脉粥样硬化、癌症或脓毒症。动脉或静脉内血液凝固的启动大多由TF 而不是Ⅻ因子所触发。

2 PDI 的结构与分布

2.1 PDI 的结构

PDI 作为一种广泛存在于真核细胞的氧化还原蛋白家族的成员，具有氧化还原酶、异构酶及分子伴侣的作用，能够催化二硫键与巯基之间的互变反应。其家族成员包括PDI、ERp57、ERp72 等20 多个成员。50多年来经众多学者分离、纯化、研究测定出PDI 蛋白是由517 个氨基酸组成:其有4 个结构域(a、b、a’、b’)、一个羧基末端伸展域(C)和连接子(X)、4 个硫氧还原蛋白样的结构域组成一个扭曲的“U”型［6］。PDI 的a 和a’域具有同源硫氧还蛋白，每个域包含一个独立的活性部位(巯基二硫键中心)，每个活性功能域包含CXXC(Cys-Xaa-Xaa-Cys)的活性位点，这两个邻位的半胱氨酸可形成二硫键或以游离巯基形式存在，调节PDI 的活动［7］。不活跃的域(b 和b’)是彼此相似的序列但不是硫氧还蛋白，它们是底物结合结构域，也有学者认为两个b 域被认为有助于其伴侣功能［8］。C-末端是内质网(endoplasmic reticulum，ER)驻留信号。在PDI 分子中，底物结合域决定其底物特异性。

2.2 PDI 的分布

PDI 在真核细胞内广泛表达，高度集中在ER 的氧化环境中，确保新形成蛋白质的二硫键的形成。虽然PDI 有一个C 端ER 保留序列，PDI 已被确定在不同亚细胞位置甚至细胞以外。已经发现PDI 分布于血小板表面及内皮细胞、白细胞和单核细胞/巨噬细胞等多种细胞［9］。

2.3 PDI 的主要功能

PDI 有很多功能，其中对硫醇二硫键的氧化还原、互换和分子伴侣活性这三个催化活动是ER 的核心功能。PDI 的氧化还原异构酶作用主要在ER 腔内进行，其中大约50%PDI 的a 和a’结构域活性中心皆为还原状态，15%PDI 的a 和a’结构域的活性中心是氧化状态;另外，20%PDI 的a 结构域活性中心是氧化状态，a’结构域的活性中心是还原状态;还有15%PDI的a’结构域活性中心是氧化状态，a 结构域的活性中心是还原态［10］。PDI 活性中心的氧化还原状态的不同决定其生理功能的不同:氧化状态时，PDI 能将来自于活性中心的二硫键传递给底物，使其形成一对二硫键，并将PDI 活性中心还原为还原态;而当PDI 活性中心为还原状态时，PDI 能使底物的二硫键产生异构，或者夺取底物的二硫键使自身的活性中心变成氧化态。

PDI 还是ER 分子伴侣家族的重要成员，作为分子伴侣，PDI 在蛋白质的翻译及翻译后进行的转运过程中均起着重要作用。PDI 区分展开、部分展开和折叠的蛋白质［11］，可帮助错误折叠或未折叠蛋白进行重新折叠。以往认为PDI 的分子伴侣活性独立于其二硫键异构酶活性而存在，然而最近有学者研究发现PDI 的伴侣活动是由它的氧化还原状态调节的。Wang 等［6］于2012年获得人类PDI 的还原和氧化形式的晶体结构，并于2013年［12］发表文章显示氧化状态有一个更开放的构象，允许伴侣蛋白的底物(如展开肽)进入与其结合，而还原型PDI 有一个封闭的构象抑制其底物的进入，这进一步说明了活跃位点的构象变化引起的氧化还原状态调节分子伴侣活性。

3 PDI 在血栓形成过程中的生物作用

3.1 PDI 对于TF 解密的作用

在生理和病理条件下，TF 是凝血的主要发起者，作为血浆蛋白酶因子Ⅶa(FⅦa)的受体和变构辅助因子，酶复合物(TF-FⅦa)通过有限的蛋白水解凝血因子Ⅹ(FⅩ)启动凝血级联反应。TF 在此瀑布式反应中起着关键作用，最终导致凝血酶生成和纤维蛋白的形成。体外研究已表明大多数TF 暴露在不同的细胞环境中处于低促凝血的或“加密”状态，需要激活步骤也就是解密，才能使TF 最大限度地表达促凝血的潜力。磷脂酰丝氨酸在应对多重刺激(如细胞溶菌作用、钙离子载体和凋亡信号)时暴露，促进TF 解密，磷脂酰丝氨酸和PDI 协同作用促进TF 的解密过程［13］。

普遍认为隐蔽的和激活的TF 的不同构象在于TF的隐蔽形式包含未配对的Cys186-Cys209 半胱氨酸硫醇，而TF 的激活形式被认为是包含一个配对的Cys186-Cys209 的二硫键［13-14］。杆菌肽是PDI 家族的非选择性抑制剂，当其存在时，TF-Ⅶa 信号被抑制，冲刷实验后，PDI 与TF 重新组合可完全逆转杆菌肽对TF-Ⅶa 信号的抑制作用。这些数据显示在细胞模型中和生理水平的TF 存在时，PDI 在TF-Ⅶa 细胞信号和凝血的直接的激活过程中充当切换开关的作用［15］。

在细胞内PDI 作为一个调节器调节TF 的功能，但是PDI 怎样使隐蔽的、非凝血形式的TF 激活现在仍未完全阐明。有人提出了PDI 通过异构化TF 的Cys186-Cys209 巯基-二硫键互换从而控制TF 促凝血和信号功能。但有数据显示:当存在FⅦa 的饱和浓度时，TF 突变体即使缺乏Cys186-Cys209 二硫键也可表现出特定的与野生型TF 相同的促凝血活性。这些数据表明，Cys186-Cys209 二硫键的形成不是TF 解密所必需的［16］。

虽然PDI 可能通过切换TF 的二硫键促进凝血，也不排除其他机制和其他PDI 目标。Versteeg 等［17］于2007年发表文章:TF 凝血功能增强独立于PDI 的氧化还原酶活性，PDI 伴侣活性足以提高TF 凝血活性。他们用杆菌肽完全封锁了PDI 对TF-Ⅶa 介导的FⅩ活化的影响。然而，当PDI 存在时，用氧化苯胂封锁附近的硫醇(硫醇是PDI 的还原酶和异构酶活动所需的，而PDI 的伴侣功能通常被认为是独立于临近的催化的硫醇)，不会降低凝血活动。这些数据表明氧化还原酶活性不影响PDI 对TF 的作用，提示PDI 通过其伴侣活性来增强TF 促凝血的活动而不是依赖于氧化还原酶的活性。然而，Persson［18］于2008年又提出相反的观点:PDI 实际上不是通过伴侣机制影响FⅩ激活。他认为是牛PDI 磷脂污染物，而不是牛PDI 本身介导FⅩ激活的增强TF-Ⅶa，因为通过重组人类PDI 无法刺激FⅩ激活TF-Ⅶa。

这些存在争议的实验数据出现的原因可能是:在体内PDI 家族成员众多，不排除与PDI 有相似活性的成员在解密TF 中起重要作用。像ERp57 与PDI 具有很高的同源性，在血栓形成和止血过程中具有重要作用［19-20］。而且很多学者在实验中研究工具单一，多以应用抑制性抗体为手段，其特异性差，可抑制PDI 家族其他成员，从而影响观察效果，阻碍了对PDI 作用的真正认识。因此制备PDI 家族各个成员特异性的抗体或其他特异性手段有助于得到正确的实验结果，对于PDI 的认识也会更加正确，而对于新型抗凝药的研制也至关重要。

3.2 PDI 介导的内源性凝血

有关PDI 介导的内源性凝血的国内外研究结果并不多。2012年，Giannakopoulos 等［21］发表文章称在抗磷脂抗体综合征患者，血栓形成是由于Ⅺ因子的二硫键被氧化还原酶硫氧还蛋白-1 和PDI 还原成自由硫醇而启动凝血。这对于抗磷脂抗体综合征的研究是有重要意义的发现。

3.3 PDI 介导的纤维蛋白生成和血小板的活化

血小板活化的最终途径都是β3整合素，其在血小板以大量的αⅡbβ3的形式存在，在内皮细胞表达为αⅤβ3而不是αⅡbβ［22］3。2012年Cho 等［23］发现在体内血栓的形成中血小板PDI 的捕获取决于β3整合素的存在。他们使用活体显微镜证明缺乏β3整合素的老鼠，在激光损伤小动脉壁的部位既无血小板血栓形成也无纤维蛋白生成。他们对野生型和β-/-3老鼠进行相互的骨髓移植进一步评估内皮细胞αⅤβ3与血小板αⅡbβ3的相对重要性。这些相互移植的老鼠，当血管损伤后PDI 积累和血小板血栓形成均显著降低。这些结果表明，内皮细胞和血小板β3整合素均促进细胞外PDI 在血管损伤部位相互作用和累积。在此之前，2008年他们应用激光诱导提睾肌动脉血栓模型，发现在小鼠受伤后的血栓中，PDI 在血管损伤部位的出现早于血小板积聚和纤维蛋白沉积［24］。注入PDI抑制剂杆菌肽或对PDI 单克隆抗体阻滞剂可抑制血小板血栓形成和纤维蛋白生成，且明显延长小鼠尾出血时间。这些结果都表明，在老鼠体内纤维蛋白生成和血小板血栓形成中，PDI 是需要的，而且β3整合素在PDI 介导的血小板活化过程中具有关键作用。

然而Kim 等［25］于2013年发现PDI 在小鼠血栓形成中起作用而不是在止血中起作用。与细胞外PDI抑制剂不同，血小板特定的缺乏PDI 的老鼠与野生型老鼠相比没有显示更长的尾出血时间［其时间分别为(120.0 ±32.8)s 和(117.5 ±28.4)s］。这些结果表明，在老鼠体内血小板PDI 的异构酶功能仅限于血栓形成，对于止血并不是必不可少的。

Jasuja 等［26］则认为对血小板血栓形成起作用的PDI 不是血小板来源的而是内皮细胞来源的PDI。他们使用活体的显微镜体内研究显示激光损伤血管壁后，实验表明在纤维蛋白生成中，内皮细胞来源的PDI是必需的，而且独立于血小板血栓形成，而血小板PDI有助于增加血栓形成有关的PDI 的总量，但不是必需的。也许这些实验结果可解释为:PDI 对于血小板活化、血小板血栓形成以及纤维蛋白生成均有作用，然而PDI 对血小板功能的影响独立于它对纤维蛋白生成的影响:激活血小板进而促进血小板血栓形成的有内皮细胞和血小板二者来源的PDI，而促使纤维蛋白生成的只有内皮细胞来源的PDI。而且血小板和内皮细胞的β3整合素对于二者来源的PDI 的捕获及介导的凝血具有关键作用。

生理条件下，血小板上的αⅡbβ3整合素处于低亲和力状态，不能结合纤维蛋白原，只有其空间构象发生改变转变为高亲和力状态才能结合纤维蛋白原，促使血栓形成［27］。如前所述，许多与血小板激活有关的膜糖蛋白受体(包括αⅡbβ3整合素)含有丰富的半胱氨酸亚单位，而血小板活化的最终途径是αⅡbβ3整合素，αⅡbβ3整合素含有56 个半胱氨酸残基，每个半胱氨酸均参与二硫键的形成，这样的结构特征可能允许PDI 调节αⅡbβ3整合素的氧化还原状态及异构化，促使其构象发生改变。αⅡbβ3整合素游离巯基的产生是与配体高亲和力结合的必需条件，而PDI 与αⅡbβ3整合素结合后催化二硫键的还原，增加游离巯基产生，空间构象发生改变，从而活化αⅡbβ3整合素转变为高亲和力状态，提高其与纤维蛋白原结合的能力，促进血栓形成［28］。

基于国内外几十年的对PDI 不断深入的研究，对于PDI 促进凝血的机制虽然尚不完全清楚，但是血栓形成过程需要PDI 的参与，而且PDI 在血栓形成过程的各个阶段均发挥作用是肯定的，而且大量研究证实PDI 的抑制剂可阻滞血栓形成的最初阶段，抑制两条凝血途径。已有的抗凝剂虽然能抑制血小板聚集或纤维蛋白生成，如抗血小板药物阿司匹林，抗凝药物肝素、华法林等，作用于GPⅡb/Ⅲa 受体的阿昔单抗等，但其预防、治疗效果不理想。诸多学者致力于研究PDI 抑制剂作为抗凝治疗的替代目标。

4 PDI 抑制剂

目前使用最广泛的PDI 的小分子抑制剂是杆菌肽，杆菌肽是PDI 和PDI 的家族其他硫醇异构酶的抑制剂，杆菌肽浓度增加导致在血管壁损伤后纤维蛋白沉积和血小板聚集减少［24］。抗PDI 单克隆抗体RL90的功能与杆菌肽相似［29］。最有效的抑制剂是五羟黄酮-3-芸香糖甙，也称为芦丁，是一类黄酮类化合物，常见于果实和蔬菜。对于硫醇异构酶家族而言，这是PDI 的选择性抑制剂，不抑制ERp5、ERp57、ERp72、硫氧还蛋白或硫氧还蛋白还原酶［8］。在激光损伤血管后五羟黄酮-3-芸香糖甙抑制血小板聚集和纤维蛋白形成［30］。当小鼠被注入重组PDI 后，五羟黄酮-3-芸香糖甙的抗血栓形成的效果就可完全被逆转。这个实验证实，五羟黄酮-3-芸香糖甙通过阻断PDI 抑制血栓形成。这些临床前研究表明，抑制PDI 是一个阻止血栓形成比较容易实现的方法。但是在无PDI 的血小板，五羟黄酮-3-芸香糖甙明显阻碍血小板聚合和三磷酸腺苷分泌，表明其具有抑制PDI 以外的额外效果［25］。在以后的研究中这一点应当加以注意。不过五羟黄酮-3-芸香糖甙及其衍生物或更为特异性的单克隆抗体有望成为新型抗凝药。

5 展望

血栓形成是血小板、多种蛋白、凝血因子协同作用的结果。参与调节的蛋白活化时都需要变构二硫键发生氧化还原与变构，而二硫键异构酶负责催化二硫键氧化还原与变构。这对进一步探讨血栓形成的具体机制提供了新思路。将为血栓性疾病的预防、评估和干预提供新的启示和方向。进一步明确PDI 家族调控血小板活化和凝血系统激活的调控机制，有助于开发以二硫键异构酶为靶向，同时具有阻断血小板活化和凝血系统激活的双重作用的抗血栓药物的研发。同时由于目前无有效而特异的工具来进行研究，对PDI 在血栓形成中的认识仍存在不少缺陷，而其也将成为新的热点。

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