长期保存绵羊冻精的贮运实践与体会

杨菊清，田可川，周光瑞，杨开伦，臧长江，张增强，周新华，刘汉民

（1.新疆伊犁职业技术学院，新疆 伊宁 835000；2.新疆维吾尔自治区畜科院畜牧所，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆维吾尔自治区畜禽改良总站，新疆 乌鲁木齐 830000；4.新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐 830052；5.新疆巩乃斯种羊场，新疆 新源 835808；6.新疆伊宁县畜牧局，新疆 伊宁 835100）

长期保存绵羊冻精的贮运实践与体会

杨菊清1，田可川2，周光瑞3，杨开伦4，臧长江4，张增强5，周新华6，刘汉民5

（1.新疆伊犁职业技术学院，新疆 伊宁 835000；2.新疆维吾尔自治区畜科院畜牧所，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆维吾尔自治区畜禽改良总站，新疆 乌鲁木齐 830000；4.新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐 830052；5.新疆巩乃斯种羊场，新疆 新源 835808；6.新疆伊宁县畜牧局，新疆 伊宁 835100）

在攻克绵羊冻精长期保存技术后，我国生产的第一批绵羊颗粒冻精已创造了我国绵羊冻精保存时间最长的纪录。本批冻精进行的验证性输精结果均表明，冻精的品质在长期冷冻保存期里的贮存与转运过程中都得到了有效保护，对冻精的品质没有产生显著的不利影响。在我国首批绵羊颗粒冻精保存时间将近40年之际，我们特总结长期保存期间该批冻精在储存、运输方面的成功经验和实践体会，供同行参考。

绵羊；冻精；贮存；运输；体会

20世纪70年代中期(1975年12月-1976年1月)，由新疆巩乃斯种羊场、新疆畜牧研究所（现为新疆畜牧科学院畜牧所）、新疆八一农学院（现为新疆农业大学）和新疆畜禽改良总站的科研人员，使用国家于1972年首次进口的纯种澳洲美利奴种公羊冻制了我国在攻克绵羊冻精长期保存技术后的第一批绵羊颗粒冻精[1,2]。该批冻精制成后，曾分批存放在新疆畜禽改良总站、新疆畜牧研究所、新疆巩乃斯种羊场和伊犁州畜禽改良总站等单位，用于长期保存或科研使用。为了观察保存效果，同时也根据细毛羊各时期育种计划和科研的需要[3]，在长期保存期间使用该批冻精先后进行了8次绵羊输精试验，共解冻冻精颗粒1 291粒，输精母羊963只，产羔母羊363只，生产羔羊415只，平均受胎率为37.69%、平均产羔率114.33%[4]。试验结果还表明，冻精解冻活力评分每提高0.1分，平均受胎率提高9.32%，平均产羔率提高8.33%[5]。目前，该批绵羊颗粒冻精已创造了我国绵羊冻精保存时间最长的纪录，在保存时间将近40年之际，我们特此就该批冻精在长期保存期间储存、运输方面的成功经验和实践体会进行了总结。

1 冻精长期保存前的准备工作

绵羊冻精保存年限在10年以上而且尽可能长远地保存下去，即可称之为“长期保存”。通常，具有特殊利用价值种用公羊的精液才具有长期冷冻保存的必要，因此，在做出对某个种公羊精液进行长期保存的决定时，对该种公羊的育种价值、科研价值的正确评估就显得尤为重要。已选择好种公羊的精液在完成冻制之后，正式进入长期保存之前，还需要在贮存间的选址与建设、贮存容器的选择与准备、人员上岗培训等方面做好相应的准备工作。

1.1 贮存间的要求

用于存放冻精的贮存间，首先要求宽敞明亮，具备良好的通风、换气条件，防水防潮，防鼠防虫；室内空气洁净无异味，空气质量必须达到或者超过国家标准（具体可参照室内空气质量标准GB50325-2001），如果选择地下贮存室则要求将通风换气列为首选条件。其次，贮存间要避开热源、有害气体源和辐射源：避开热源可减少液氮挥发，能有效降低精液储存成本；挥发性有机物（VOCs）如油漆、胶粘剂、涂料等装修材料散发的有害气体可能间接地影响到保存质量；辐射源发出的射线可以透过液氮罐罐体，对精子造成直接威胁。冻精贮存间的安全防护措施主要针对液氮意外外泄的处置来拟定，应急预案及安全防护措施要在入口处张贴，使所有管理人员都清楚遇到液氮外泄时的正确处理步骤和方法。

1.2 液氮罐选择与准备

液氮罐的质地优劣不仅直接关系到精液保存的质量，甚至还可决定冻精保存的成败，所以长期使用的液氮罐必须保证质量上乘。可根据冻精数量多寡选择不同容量的液氮罐盛放冻精，液氮容量规格通常以30~35 L为宜；本次保存过程中曾使用过60 L的液氮罐，虽然可以贮放的冻精量更多，但由于罐内液氮的水平面大，可能导致挥发量增大。如条件允许，在贮存间静置长期保存的冻精可以使用储存型的液氮贮存罐。液氮罐使用前先做好全面清洗消毒，清洗程序须严格按照液氮容器清洗的相关要求进行操作，为了保证储藏质量，每年还要对正在使用的液氮罐内部进行清洗1~2次。同时需要多备2~3个液氮罐，随时准备替换旧罐或者以防不虞。

1.3 分装与标记

供长期保存的绵羊颗粒冻精最好放置在纱布袋里，可按照100粒/袋进行分装；分装时必须注意，不同种公羊的冻精必须分开装袋，不得混装。分装同时必须即时做好标识，即预先（装入冻精后就无法进行标记）在准备装入颗粒冻精的纱布袋上用标记笔（油笔）简单标明序号、公羊号、冻制日期和数量；分装后，拉紧贯穿整个纱布袋环口的粗棉线收紧袋口，以防冻精从袋中滑落，留适当长度的棉线头置于液氮罐外固定以防止滑脱，线头端可缝合白布片，上面记载序号、品种、羊号、生产日期、精子活力及颗粒数；但须注意，如果罐口挂线太多同样可能会增加液氮的消耗。分装好颗粒精液的纱布袋可放入液氮罐配置的提筒内进行保存，也可以将纱布袋直接浸入液氮之中或者沉入罐底。以上冻精信息及分类存放的位置图，必须清晰准确地记载在纸质登记簿上备查。

1.4 人员与岗位责任制

长期保存的绵羊颗粒冻精必须要有专人负责管理、使用和保养，同时需要制定岗位责任制，明确职责。所选人员必须要有高度的责任心和较好的专业素养，工作认真负责，做事细致可靠。而且上岗前必须进行专业技术培训，重点使之了解液氮的特质特性，熟练掌握使用和保养液氮罐的基础知识，牢记相关操作技术规程和发生情况时的应急处理。

2 贮存的技术要求

随着冻精保存时间的延续，贮存间温度的细微改变、光线照射及微小震动等因素都可能导致冻精品质的降低，进而影响到解冻后精子的活力和授精能力，严重时可能导致前功尽弃。因此，贮存间的温度应尽可能地保持相对稳定，不能大起大落，变化剧烈。本批冻精保存期间经历了数十个寒暑季节交替，由于条件所限，贮存间的温、湿度随寒暑而变化，室内温度：夏季10℃~20℃、冬季-20℃~5℃；相对湿度：夏季45%~60%，冬季45%~65%；在最近抽检的19个样品中，解冻后活力在3分（低于3分者不可用于输精）的样品占到89.47%，仅有10.53%的样品解冻后活力为1分，说明现有的保存环境条件是基本符合绵羊冻精长期保存要求的。在本批冻精保存期间，我们主要做了以下工作：

2.1 随时观察罐体变化

冻精长期保存的关键是使冻精必须始终浸泡在液氮中，所以储存期液氮罐的摆放状态与位置均很重要，要求液氮罐必须始终保持直立状态，不得倾斜、横放、倒置、堆压、相互撞击或与其他物件碰撞，操作时也要做到轻拿轻放，严禁暴露在太阳光线下直晒；罐口要用罐塞盖好，但又不能密闭，以防爆罐。同时管理人员必须随时对贮存间的所有储精液氮罐进行逐一详细检查，检查内容包括液氮罐的状态和液氮的损耗。如发现液氮罐罐体有出汗、颈口结霜等异常现象，都是容器隔热性能变差的表现，应立刻停止使用，速将冻精转入其他性能好的罐内。

2.2 定期液氮补充

保存期间，每隔一周（7 d）要检查一次罐内的液氮容量，当剩余液氮为液氮罐容量的2/3时，就应及时进行补充。管理人员可根据液氮罐的体积编排出液氮补充的周期表，张贴备忘；还可采用称重法或木条测量的方法推算出罐内液氮存量和应补充量，称重法：将液氮罐放在台秤上测重，如YDS-30型液氮罐的空重为13 kg，满重为38.5 kg，用满罐时的重量减去现有秤重，就是应补充的的液氮重量，然后按照一立升液氮重0.8 kg计，可以推测出需添补的液氮量；木条测量法简便实用：用一根细木棒插入液氮内数秒钟，将细棒迅速取出在空气中摇晃几下，插入液氮的部份因温度低而结成白霜，很易容检测出罐内液氮的存量水平。在补充液氮时，一定要注意防护，避免冻伤、喷溅、窒息等现象的发生。

2.3 按计划抽检品质

为了随时掌握冻精的保存质量，有必要制定计划进行定期抽检。考虑到本批冻精的珍贵程度和有限数量，本批冻精每年只抽检1次，而且采取“一罐一样”，即不对同一罐中的所有公羊冻精全部抽测，而是随机取1个样品（3粒混精）代之。抽查时，应先将放置冻精的提筒略微提高，使提筒离开底座，再将提筒平行移至液氮罐的中央部位，顺其自然向上提，动作要轻便迅捷，不得使用蛮力，以免扭弯或折断提筒的把柄，同时还要注意避免提筒擦碰液氮罐的颈管和内壁，造成损坏；提筒严禁提出液氮罐外，在罐内脱离液氮的时间不得超过10 s。如果是直接沉入罐底的纱布袋，则可将棉线轻轻牵出，用在液氮中浸泡过的长镊子解开袋口取出精液颗粒，同样袋口不得离开液氮面10 s。完成抽样后，提筒手柄要在分度圈内放妥，盖好罐塞以减少液氮蒸发。

2.4 记录备案

冻精保存过程中，每次出、入库过程都有详细的登记备忘材料，精液分发、损耗报废的冷冻精液数量、存罐补充液氮的数量等必须如实记载清楚，并且做到每月结算。每次品质抽检都要有记录，记载内容包括：抽检时间、罐号、公羊号、活力评分等内容。因工作需要进行管理人员更换时，要有交接记录。

3 冻精转运中应注意的事项

本批保存的澳洲美利奴羊冻精弥足珍贵，对我区乃至我国细毛羊业的发展影响巨大且深远。由于中国美利奴羊（新疆型）及其各品系类型（细毛型、毛密品系、毛质好品系等）育种与科学研究的需要，本批冻精在保存期间，经常转运分发到各羊场或者牧区配种站进行输精，转运距离动辄数百千米，期间使用的运输工具除液氮运输车外，还有小汽车、小型货运车、摩托车和犍牛等。其中，1991年9月间，在新疆巩乃斯种羊场的卡拉干特夏牧场配种站进行试验性输精时，在陡峭的山路上是使用犍牛驮运的，装有冻精的液氮罐被绑在犍牛背的鞍鞯上驮行了2 h抵达配种站，输精结束（输精20 d）后，同样用犍牛驮行从原路返回；2008年8月，在尼勒克县唐布拉夏牧场配种站试验性输精所用冻精，在崎岖的山路上则是采用摩托车运送的，冻精被运到海拔高程近3 000 m的配种站进行输精；两次输精试验结束后剩余的精液均在返回基地后继续保存。由于转运过程中的强烈震动也会降低冻精的品质，因此，一定要认真仔细地做好运输途中的管理。

3.1 使用运输型液氮贮运罐

为了满足长途运输的条件，运输型液氮贮运罐作了专门的防震设计，可承担运输和振动。液氮罐在长途运输过程中必须套上厚外套，然后装在木架内并垫好软垫，罐与罐之间要用填充物隔开，防止颠簸撞击，避免剧烈的碰撞和震动，特别要严防倾倒发生事故。装卸车时则要避免液氮罐碰击，更不能在地上随意拖拉，以免缩减液氮罐的使用寿命。用车辆输送和搬运时，液氮由于车辆的振动而跟着振荡，从而增加消耗速度，因此需要计算好液氮存量，或者做好中途补充的准备。长途运输途中，如遇到三级或三级以下的路面，汽车的时速不宜超过30 km/h。

3.2 选择容积较小的容器运输

在短时间、短距离内转运冻精，可以选择容积较小的容器运输，如5~15 L的小型液氮罐即可以用于贮存冻精，必要时还可以运送液氮。前往交通不便的深山牧区配种站运送冻精，则要计算好液氮的消耗量，提前做好准备，随时添注液氮。我们的做法是在距离配种站最近的公路合适处，建立临时液氮补充点，使得装有冻精的液氮罐在上山前、下山后，均尽可能得到最快的补充。在不具备交通条件的牧区转运精液时，建议不要用液氮罐中的提筒贮存精液，而是直接将冻精袋沉入液氮最为安全便捷。

4 讨论

4.1 绵羊冻精长期保存是系统工程，没有国家的大力支持是难以完成的

冻精的长期保存条件要求非常高，期间需要不间断地投入大量的人力、物力和财力，仅靠保存单位的资金投入是远远不够的。目前，在本批冻精保存的40年里，新疆畜科院畜牧所、新疆畜禽改良总站、新疆农业大学、新疆巩乃斯种羊场、伊犁州畜禽改良站等单位数以百计的科技人员参与了此项工作，并为之付出了辛勤的劳动，这是无法用金钱计算的；同时在冻精保存上的直接开支也是巨大的，据初步统计，本批冻精保存期间的液氮损耗总量就达到了7 000 L。

4.2 绵羊冻精的长期保存在学术研究和生产上均有重大意义

绵羊精液冷冻保存，有利于育种和优质基因的保存，使用上可不受种公羊生命、时间和地域的限制，无论在学术研究上，还是在生产上都有重要的意义和价值。如几次试验性输精配种，除顺利完成了育种计划和科学研究的内容外，还对试验羊场现有的羊群起到了换血的作用，对试验羊场的生产水平和羊群品质提高起到了积极推动作用。尽管绵羊冷冻精液还有许多理论、技术和方法等问题至今没有很好的解决，与使用鲜精相比，受胎率还有一定的差距[6]，但对绵羊冷冻精液研究与探索的步伐并没有停滞。由于本批绵羊冻精的特殊性，缺乏与之进行直接比较的参考数据，但作为该领域的先行者，收集积累的各种试验数据，可以对今后同类型科研实践起到指导与借鉴的作用。

4.3 新疆在绵羊冻精长期保存这方面的研究探索处于国内领先地位

理论上，冻精是可以无限期地进行保存的，但冷冻精液的保存期限到底有多长，在医学界曾引起巨大争议，至今尚无定论。迄今国内的相关文献报道中，以本批绵羊冻精保存的期限最为长久，而国外（澳大利亚）只是报道了使用冷冻保存16年绵羊精液进行的人工授精试验（其受胎率达58%~66%）[7]，但此以后再未见类似的文献报道。本批冻精进行的系列验证性输精的结果多次证明，绵羊精液确实是可以长期保存，使用经过长期冷冻保存的精液输精也不会增大产生畸形羔羊的比例[8]；试验结果还表明，本批绵羊精液在长期冷冻保存过程中的正常贮、运活动对冻精的品质均没有产生显著的不利影响。

[1]胡连志，杨菊清，郭文惠，等.腹腔境绵羊宫内输精初试[J].中国畜牧杂志,1989, 25(5):22.

[2]胡连志，徐佩贤，段长存，等.冷冻保存十五年的绵羊精液受胎效果[J].草食家畜,1993,(3):20.

[3]田可川,阿扎提,史梅英,等．保存20年的美利奴羊冻精腹腔镜输精试验[J].中国畜牧杂志,1999,(1):33.

[4]杨菊清,张增强,周光瑞,等.绵羊冻精不同保存年限的受胎效果连续观察[J].草食家畜,2009,（3）:40-43.

[5]杨菊清,杨风云,张增强,等.长期保存绵羊冻精的解冻活力与受胎效果观察[J].中国草食动物科学, 2013, 33(1):26-29.

[6]赵有璋.中国养羊学[M].北京:中国农业出版社.2013.

[7]福井丰,王凤瑞.绵羊冻精的长期保存[J].草食家畜,1986,(02): 10.

[8]周光瑞,杨菊清,等．长期保存的绵羊冻精输精受胎效果观察[J].2010年新疆畜牧兽医学会年会论文集,新疆畜牧兽医学会内部资料,2010:1-3．

Storage and Transport of Long-term Preservation of Sheep Frozen-semen

YANG Ju-qing1,TIAN Ke-chuan2, ZHOU Guang-rui3，YANG Kai-lun4，ZANG Chang-jiang4，ZHANG Zeng-qiang5, ZHOU Xing-hua6，LIU Han-min5

（1.Yili Vocational Technolgy College，Yining 835000，China; 2．Animal Science Academy of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，China; 3．Animal Breeding & Improving Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，China; 4．Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China; 5．Xinjiang Gongnaisi Stud Farm，Xinyuan Xinjiang 835808，China; 6. Animal Husbandry Bureau of Yining County，Yining 835808，China）

With the development of preservation technology of sheep frozen-semen, the first batch of sheep frozen-semen recorded the longest storage time period in China. Testing results showed that the quality of sheep frozen-semen was effectively protected during storage and transport. Moreover, it also showed that we have led the world in the research of long-term preservation of sheep frozen-semen. After reaching a 40-year storage record of the first sheep frozen-semen, we summarized the successful experience in sheep frozensemen storage and transport during the long -term preservation in order to provide references for semen preservation.

sheep；frozen-semen；storage；transport

S826

B

1003－6377（2015）04－0026-05

国家绒毛用羊现代产业技术体系建设项目(CARS-40-43）

杨菊清（1964-），男，博士，农业推广研究员，长期从事绵羊科研、育种、生产与教学工作。E-mail：497210459@qq.com

2015-04-11，

2015-04-23