安徽省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

顾超逸，孙 裴，施 雷

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

安徽省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

顾超逸，孙 裴，施 雷

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

【目的】 研究安徽地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ORF3基因序列特征。【方法】 于2012-2013年，从安徽省合肥、肥东、肥西、滁州、亳州、阜阳、马鞍山、蚌埠、宿州、巢湖、六安、淮南、宣城和淮北地区的19个不同猪场采集93份病料，采用RT-PCR方法对PEDV ORF3基因进行扩增，测序后进行序列分析，并与韩国、欧洲及中国其他省份PEDV毒株进行同源性比较，并构建遗传进化树。【结果】 在93份病料中，自20份病料中获得的PEDVORF3基因开放阅读框全长为810 bp，编码224个氨基酸，较多的基因位点发生了突变，没有缺失和插入。安徽省PEDV毒株之间的同源性为96.7%～100.0%，与欧洲株同源性为94.9%～97.0%，与韩国株同源性分别为96.3%～98.7%，与中国其他省份分离株的同源性为95.9%～100.0%。【结论】 安徽地区PEDVORF3基因与韩国株亲缘关系较近，而与欧洲株亲缘关系较远。

猪流行性腹泻病毒；ORF3基因；基因分析；安徽

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)抗原Ⅰ群的成员，是有囊膜的不分节段的单链正股RNA病毒，目前仅见1个血清型[1]。PEDV与同属的人类冠状病毒229E、传染性胃肠炎病毒和猫传染性腹膜炎病毒亲缘关系较近[2]。PEDV基因组全长约28 033 bp (PEDV CV777株)，5′端有帽子结构,3′端有一个Poly(A)尾。PEDV基因组内有6个主要的开放阅读框，编码典型的冠状病毒结构蛋白，从5′→3′端依次为编码复制酶多聚蛋白(lab)、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)的基因[3-4]。

PEDV ORF3蛋白为224个氨基酸的多肽，分子质量为25.3 ku，是一种非结构蛋白，其位置在第116-784个核苷酸之间[5-6]。2007年Park等对DR13强毒株、Vero细胞传100代致弱株及12株野毒株的ORF3基因序列进行了分析，发现Vero细胞传100代致弱株与其他强毒株相比出现了51个核苷酸的缺失，为区分PEDV强弱毒株提供了依据[7-9]。ORF3蛋白是PEDV基因组编码的惟一的一个辅助蛋白。研究表明，ORF3基因编码一个离子通道，通过对强弱毒株之间的比较分析可知，该通道与病毒毒力的大小密切相关[10-11]。

1971年，PED首次在欧洲被发现，临床症状与传染性胃肠炎相似，发病率较高，死亡率较低。自2010-10开始，PED在我国大面积流行，哺乳仔猪死亡率高达100%。安徽省位于华中、华南腹泻严重地区的交汇处，在该病的流行中起了重要的作用。本研究对安徽地区PEDVORF3基因进行分析，旨在为猪流行性腹泻的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料的采集与处理

于2012-2013年采集安徽地区合肥、肥东、肥西、亳州、阜阳、滁州、马鞍山、蚌埠、宿州、巢湖、六安、淮南、宣城和淮北地区的19个不同猪场内腹泻仔猪的肠内容物、十二指肠、空肠、回肠及肠系膜淋巴结的混合样品共93份。其中蚌埠地区2次采样为同一猪场，其他重复采样地区均为不同猪场。

将采集的病料放入研磨器内，以1 g加10 mL的比例加入无菌PBS (100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，pH 7.2)，研磨成组织匀浆,反复冻融4次，12 000 r/min离心10 min，无菌吸取上清液，于-80 ℃保存备用。

1.2 试 剂

总RNA提取试剂盒购自Omega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、2×GoTaqMaster Green Mix、M-Mlv反转录酶和5× first strand buffer购自Tigen公司， DEPC原液购自上海生物工程有限公司。

1.3 引 物

参考GenBank上已公布的PEDV CV777株 (GenBank登录号AF353511)的基因序列设计一对引物用于扩增ORF3基因。引物由上海生物工程有限公司合成。上游引物：5′-TCCTAGACTTCAA-CCTTACG-3′，下游引物：5′-GGTGACAAGTGAA-GCACAGA-3′。预期扩增的基因片段约为810 bp。

1.4 ORF3基因的扩增

取一无菌离心管，加入冷冻保存备用的病毒液100 μL，按总RNA提取试剂盒说明书步骤提取RNA，用1.3的下游引物作为反转录的引物，将RNA反转录为cDNA。反应体系为：dNTP 3 μL(2.5 mol/mL)，引物1 μL(10 pmol/μL),5×first strand buffer 5 μL，RNA模板6 μL，补充无菌双蒸水至总体积为20 μL。反应条件为：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。将反转录获得的cDNA置于-20 ℃下备用。

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为2×GoTaqMaster Green MIx 25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各2 μL,cDNA模板2 μL，加入无菌双蒸水补至总体积为50 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。阴性对照为双蒸水，阳性对照为PEDV弱毒疫苗。

1.5 ORF3基因序列分析

取PCR扩增的产物20 μL,在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，经胶回收后送往上海生物工程工有限公司测序，用DNASTAR软件比较其与其他PEDV毒株序列的同源性，并绘制遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 PEDV ORF3基因片段的RT-PCR扩增鉴定

93份病料中，有20份经RT-PCR扩增获得的PEDVORF3基因开放阅读框全长为810 bp (图1)，编码224个氨基酸。

图1 PEDV ORF3基因的RT-PCR扩增结果
1.阳性病料；2.阳性对照;3.阴性对照;4.DNA Marker DL2000
Fig.1 Electrophoresis pattern of RT-PCR products of ORF3 gene
1.PCR product of ORF3 gene;2.Positive control;3.Negative control；4.DNA Mark DL2000

2.2 PEDV ORF3基因序列及编码氨基酸序列分析

对20株PEDVORF3进行测序，并将测序结果提交至GenBank，获得的登录号见表1。20株PEDVORF3均有完整的开放阅读框，由810个核苷酸组成，编码224个氨基酸。与参考株PEDVCV777基因序列相比，20株安徽株于497位发生A→G突变，62、393位发生T→C突变，160、235、301位发生G→A突变，243、450位发生C→T突变。AHLA、AHFR、AHLX、AHBB、2013AHBB株于208位发生A→G突变，555位发生A→C突变，39、74、318位发生T→C突变，108位发生T→G突变，99位发生C→T突变，135位发生G→C突变。2013AHLA、2013AHHB株于24位发生C→T突变，206位发生A→G突变。

将推导的氨基酸序列与PEDV CV777相比，20株安徽株于21位发生V→I突变，54、79位发生V→I突变，92位发生L→F突变，101位发生A→T突变，166位发生N→S突变，182位发生H→Q突变。AHLA、AHFR、AHLX、AHBB、2013AHBB株于25位发生L→S突变，70位发生I→V突变，88位发生Y→H突变，107位发生C→F突变。2013AHLA、2013AHHB株于69位发生Y→C突变，145位发生V→A突变。

2.3 PEDV毒株的ORF3基因同源性分析

将20株安徽地区PEDV毒株与比利时Br/87(GenBank登录号：Z24733)，英国CV777株(GenBank登录号：AF353511)，韩国株DR13(GenBank登录号：EU054930)、VF131(GenBank登录号：EU537444)、Chinju99(GenBank登录号：EU792474)、PFF188(GenBank登录号：HQ537445)，中国株JSYC2012(GenBank登录号：KC161199)、JSTS2012(GenBank登录号：KC161198)、AJ1102(GenBank登录号：JX188454)、CHGD-1(GenBank登录号：JN980697)ORF3基因序列同源性进行比较，结果见表2。由表2可知，安徽地区PEDV株之间的同源性为96.7%～100.0%，与欧洲株同源性为94.9%～97.0%，与韩国株同源性为96.3%～98.7%，与中国其他省份分离株的同源性为95.9%～100.0%。2012年安徽地区PEDV毒株中出现了较多相同的ORF3基因序列，其中AHHN、AHSZ、AHSX、AHGD、AHFX、AHYSORF3基因序列同源性为100.0%。2013年安徽地区PEDV毒株之间ORF3基因的同源性下降，出现相同基因序列毒株的比例明显降低。

注：1～20号依次为安徽地区毒株AHHN、AHSZ、AHSX、AHFR、AHFD、AHLA、AHFY、AHLX、AHBB、AHGD、AHFX、AHYS、2013AHLA、2013AHCH、2013AHLX、2013AHHB、2013AHDY、2013AHMAS、2013AHFD和2013AHBB;21.Br/87;22.CV777;23.DR13;24.VF131;25.Chinju99;26.PFF188;27.JSYC2012;28.JSTS2012;29.AJ1102;30.CHGD-1。

Note:1-20:ORF3 gene PCR products of Anhui strains:AHHN,AHSZ,AHSX,AHFR,AHFD,AHLA,AHFY,AHLX,AHBB,AHGD,AHFX,AHYS,2013AHLA,2013AHCH,2013AHLX,2013AHHB,2013AHDY,2013AHMAS,2013AHFD and 2013AHBB;21.Br/87;22.CV777;23.DR13;24.VF131;25.Chinju99;26.PFF188;27.JSYC2012;28.JSTS2012;29.AJ1102;30.CHGD-1.

2.4 PEDV ORF3遗传进化分析

基于ORF3基因序列的PEDV遗传进化分析结果见图2。

图2 基于ORF3基因序列的安徽PEDV株与其他地区毒株的遗传进化树
Fig.2 Phylogenetic analyses based on the nucleotide sequences ofORF3 gene from Anhui and other areas

图2显示，本试验将30株PEDV毒株可以分为2大类群。其中20株PEDV安徽株、韩国株及我国其他省份毒株组成G1类群，欧洲株CV777和Br/87组成G2类群。其中G1类群又分为G1a和G1b子群，G1a子群由8株2012年安徽株和7株2013年安徽株组成，同属该子群的还有江苏株(JSTS2012、JSYC2012)和韩国株(PF188、Chinju99、DR13、VF131)；4株2012年安徽株、1株2013年安徽株、武汉株(AJ1102)、广东株(CHGD-1)组成了G1b子群。

3 讨 论

PED在1971年首次报道于欧洲，我国在1976有感染该病的报道[12]。该病以猪的水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征，常见由PEDV与传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的混合感染[13-14]。本研究通过对安徽地区19个地区猪场的93份病料进行RT-PCR检测，发现PEDV与轮状病毒的混合感染仅1例，与传染性胃肠炎病毒的混合感染有2例。2009年，韩国首次报道了由于PEDV变异毒株引起该国PED的爆发。2010年，PED在我国东南沿海地区大流行，对我国生猪产业造成了灾难性的打击[15]。2011年，Chen等[16]首次公布了PEDV变异株CH/FJND/-03/2011的全基因组序列，随后不断有变异毒株的基因组序列被报道。本研究中，2012年PEDV安徽株ORF3基因之间同源性较高，出现多个相同序列；而2013年PEDV安徽株ORF3基因之间同源性普遍下降，ORF3基因序列完全相同的毒株明显减少。基于ORF3基因的遗传分析显示，安徽地区PEDV毒株与欧洲毒株遗传关系较远，与韩国和中国毒株遗传关系较近；15株PEDV安徽株与江苏株处于同一进化分支，这可能与两省地理位置临近，存在生猪交易有关。基于ORF3基因的分析，推测PEDV在安徽地区流行的过程中适应了环境，在选择性压力下发生了一定的变异。本试验分析了安徽地区PEDV毒株ORF3基因的序列特点，这对PEDV的深入研究有一定的参考价值。

[1] 斯特劳 B E．猪病学 [M].8版.赵德明,张仲秋,沈建忠,译.北京:中国农业大学出版社,2000:181-187.

Stellau B E.Diseases of swine [M].8th edtion.Zhao D M,Zhang Z Q,Shen J Z,translated.Beijing：China Agricultural University Press,2000:181-187.(in Chinese)

[2] Bridgen A,Kocherhans R,Tobler K,et al.Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhea virus confirms that this is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus [J].Gen Virol,1993,74:1795-1804.

[3] Chen J F,Wang C B,Shi H Y,et al.Complete genome sequence of a Chinese virulent porcine epidemic diarrhea virus strain [J].Virol,2011,85:11538-11539.

[4] Brian D A,Baric R S.Coronavirus genome structure and replication [J].Current Topics in Microbiology and Immunology,2005,287:1-30.

[5] Duarte M,Tobler K,Bridgen A,et al.Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF [J].Virology,1994,198:466-476.

[6] Woods R D.Efficacy of a transmissible gastroenteritis coronavirus with an altered ORF3 gene [J].Can J Vet Res,2001,65:28-32.

[7] Song D S,Yang J S,Oh J S,et al.Differentiation of a Vera cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF3 [J].Vaccine,2003,21(17/18):1833-1842.

[8] Seong J P,Hye K K,Dae S S,et al.Complete genome sequences of a Korean virulent porcine epidemic diarrhea virus and its attenuated counterpart [J].Virol,2012,86(10):59-64.

[9] Seong J P,Hyoung J M,Yuzi L,et al.Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses [J].Virus Genes,2008,36:95-104.

[10] Wang K,Lu W,Chen J F,et al.PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production [J].FEBS Lett,2012,586(4):384-391.

[11] Schmitz A,Tobler K,Suter M,et al.Prokaryotic expression of porcine epidemic diarrhea virus ORF3 [J].Adv Exp Med Biol,1998,440:75-80.

[12] 程庆华，牛小迎，叶成玉．青海地区猪流行性腹泻病调查 [J].青海畜牧兽医杂志，1992,22(3):22-23.

Cheng Q H,Niu X Y,Ye C Y.Investigation on epidemic diarrhea in pigs in Qinghai Province [J].Chinese Qinghai Journal of Animal and Veterinary Sciences,1992,22(3):22-23.(in Chinese)

[13] Debouck P,Pensaert M.Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirs,CV777 [J].Am J Vet Res,1980,41(2):219-223.

[14] Debouck P,Pensaert M,Coussement W.The pathogenesis of an enteric infection in pigs,experimentally induced by the coronavirus-like agant,CV777 [J].Vet Microbiol,1981,6(2):157-165.

[15] Sun R Q,Cai R J,Liang P S,et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China [J].China Emerg Infect Dis,2012,18(1):161-163.

[16] Chen J F,Liu X Z,Shi D,et al.Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus variant [J].Journal of Virology,2012,86(6):34.

Sequence analysis ofORF3 gene of porcine epidemic diarrhea virus in Anhui Province

GU Chao-yi,SUN Pei,SHI Lei

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 This study aimed to investigate sequence features of ORF3 gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Anhui province.【Method】 A total of 93 samples were collected from 19 different farms in Hefei,Bozhou,Fuyang,Maanshan,Bengbu,Suzhou,Caohu,Lu’an,Huainan,Xuncheng,and Huaibei in Anhui during 2012-2013.RT-PCR method was used for gene amplification and nucleotide sequences were analyzed after being sequenced.The results were compared with strains from other areas and phylogenetic tree was constructed.【Result】 20ORF3 genes out of 93 samples from Anhui had the open reading frame of 810 bp,encoding 224 amino acids.A large number of mutations occurred.The homology ofORF3 gene in Anhui PEDV were 96.7%-100.0%.The homology of ORF3 gene compared with European,Korea and other China strains were 94.9%-97.0%,96.3%-98.7% and 95.9%-100.0%,respectively.【Conclusion】ORF3 genes of Anhui isolates were genetically close to PEDV Korea strains while distantly related to European strains.

pig’s porcine epidemic diarrhea virus;ORF3 gene;genetic analysis;Ahhui Province

2013-10-22

现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目(CARS-36-生猪)；安徽省生猪产业技术体系资金资助项目

顾超逸(1988-)，男，江苏南通人，在读硕士，主要从事预防兽医学研究。E-mail：570525345@qq.com

孙 裴(1979-)，男，安徽合肥人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事分子病原学与免疫学研究。 E-mail：sunpei1979@126.com

时间:2015-01-05 08:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.02.016

S852.65+1

A

1671-9387(2015)02-0001-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150105.0859.016.html