岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导LrNAC转录因子基因的克隆及表达

张响玲，罗建让，张延龙，牛立新，孙道阳，梁振旭

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导LrNAC转录因子基因的克隆及表达

张响玲，罗建让，张延龙，牛立新，孙道阳，梁振旭

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 探索岷江百合(Liliumregale)的抗病毒病机制，为开展百合抗病毒育种工作奠定基础。【方法】 对岷江百合叶片接种黄瓜花叶病毒(CMV)，采用RACE技术克隆岷江百合NAC转录因子基因(LrNAC)，对其全长cDNA序列进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR对LrNAC转录因子基因的器官特异性及CMV侵染后该基因的表达模式进行分析。【结果】LrNAC转录因子基因全长827 bp，可编码由208个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具有NAC家族保守结构域；该蛋白为碱性、亲水性、非分泌、不具跨膜区蛋白；分子质量为23.4 ku，等电点为9.48。LrNAC转录因子基因在岷江百合嫩叶中相对表达量最高，在嫩茎中最低；该基因可以被CMV诱导上调表达，CMV处理后岷江百合、卷丹(L.lancifolium)和宜昌百合(L.leucanthum)中，LrNAC转录因子基因的相对表达量分别在处理后4 d、3 d和4 d达到最大值，分别为处理前的38倍、3倍和13倍。【结论】LrNAC转录因子基因在岷江百合抗黄瓜花叶病毒防御反应过程中发挥作用。

岷江百合；黄瓜花叶病毒；LrNAC转录因子基因；RACE；基因表达

百合是一种集观赏、食用、药用于一体的名贵花卉，而病毒病却是制约百合产业发展的重要瓶颈，其中黄瓜花叶病毒(CMV)是国内外报道的能够侵染百合的20种病毒中危害范围最为广泛的病毒之一[1]。国内外学者在百合病毒病的防治过程中进行了各方面的研究，主要包括传统毒源清除和隔离、抗病毒品种培育、脱毒及病毒传播介体的防治等。王进忠等[2]将商陆抗病毒蛋白基因转入麝香百合中，使百合植株产生抗病毒特性。Pejman等[3]将黄瓜花叶病毒复制酶缺陷基因(CMV2-GDD)用根癌农杆菌转入栽培百合Acapulco品种中，获得2个抗CMV的株系。

岷江百合是一种抗病性极强的百合优异种质资源,对病毒具有很高的抗性[4-5]。王仙芝等[6]对百合病毒病研究发现，岷江百合对CMV、百合斑驳病毒(LSV)、百合无症病毒(LMoV)的抗病程度可以达到免疫。蚜虫(病毒传播媒介)接种试验表明，岷江百合对蚜虫的抗性极弱；CMV 和LMoV复合接种试验结果显示，接种初期岷江百合易被病毒侵染，但后期其体内病毒增长量很小[7]。由此可以推测，岷江百合可能通过特殊的生化抗病毒机制来增强自身的抗病毒能力。因此，探索岷江百合抗病毒病的特殊机制对于更好地利用这一优质的抗病毒种质资源具有重要意义。

NAC转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一[8-9]，自1996年从矮牵牛中克隆到第一个NAC转录因子基因以来[10]，目前已经发现在多种植物的基因组中都有超过100个该家族基因存在[11-14]。NAC转录因子不仅在植物的生长发育、模式建成、细胞程序性死亡等过程中发挥重要的调控作用[15-20]，而且还参与了植物的抗病原菌(包括病毒、细菌、真菌)和抗非生物胁迫反应[21]。其中，在抗病毒方面的研究表明，辣椒CaNAC1转录因子基因在辣椒轻斑驳病毒(PMMV)侵染后能够被快速诱导[22]。NAC转录因子可以通过参与病毒复制过程或与病毒蛋白因子互作从而在抗病毒过程中发挥作用[21]。水稻RIM1作为与矮缩病毒(RDV)复制有关的因子能够控制水稻对RDV的感病性[23]。拟南芥中的NAC 转录因子TIP蛋白可以与芜菁皱缩病毒(TCV)的外壳蛋白结合,两者互作能够促使拟南芥产生过敏反应从而提高对TCV的抗性[24]。鉴于NAC转录因子在多种植物抗病毒中发挥的重要作用，本研究根据CMV诱导的岷江百合cDNA文库中的LrNAC转录因子基因的EST序列设计特异引物，采用RACE技术克隆LrNAC转录因子基因的全长cDNA，并利用实时定量PCR分析LrNAC转录因子基因在岷江百合不同器官中的表达水平，以及CMV侵染后该基因的表达模式，以便了解该基因的有关特性及其在抗病防御反应中的功能，为揭示岷江百合抗病毒病的抗性机制和进一步开展百合抗病毒育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用植物材料为岷江百合(Liliumregale)、卷丹(L.lancifolium)和宜昌百合(L.leucanthum)，均取自西北农林科技大学百合资源圃。已知岷江百合、卷丹和宜昌百合接种CMV后的相对抗病毒指数分别为0.64，0.64和0.18，抗病程度分别为高抗、高抗和高感[7]。黄瓜花叶病毒从百合资源圃中感染该病毒的西伯利亚百合(L.Oriental Hybrids ‘Siberia’)叶片中获得。

采集正常生长的岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根，液氮中冷冻后，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 病毒接种处理 将CMV毒源植株过夜处理后取嫩叶1 g，加入已灭菌稀释至1 mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2)研磨后，加少量石英砂摩擦接种正常生长的岷江百合、卷丹和宜昌百合叶片，之后用蒸馏水冲洗，分别在接种后0，1，2，3，4，5和6 d取样，将所取样品液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.2.2 岷江百合LrNAC转录因子基因全长的克隆 采用改良的CTAB法[25]提取百合叶片总RNA。反转录按照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit进行。

根据已获得的黄瓜花叶病毒诱导的岷江百合cDNA文库中的EST核心序列设计3′RACE 特异引物，5′-GTAGGAGGAGCTAGCCATGGCCAAC-3′，巢式特异引物5′-GATCTCCCCGGTGTTAATGAGGGCG-3′；再根据获得的基因3′端cDNA序列设计5′RACE 特异引物， 5′-ATCGGTTCGAGACCCATTGTGGTAGAA-3′，巢式特异引物5′-TGT-GTCTGCACTTGAGGCTGAAGAAGTA-3′。引物设计用Primer 5.0软件进行，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

以接种黄瓜花叶病毒后不同时间的岷江百合叶片提取的RNA混合样为模板，使用 BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)进行 RACE cDNA 扩增。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带连接至pGEM-T Easy克隆载体(Promega)后测序(北京奥科鼎盛生物技术科技有限公司)。对测序获得的LrNAC转录因子基因的5′端序列和 3′端序列利用DNAstar软件进行拼接，获得岷江百合LrNAC转录因子基因cDNA 全长序列。

1.2.3 岷江百合LrNAC转录因子基因的生物信息学分析 采用NCBI的ORF finder预测岷江百合LrNAC转录因子基因的开放阅读框；通过NCBI网站上的BLAST搜索LrNAC转录因子基因的同源序列；用NCBI的 protein blast进行蛋白序列保守结构域分析；通过DNAman软件分析LrNAC转录因子基因的编码氨基酸；利用MEGA 5.1 构建系统发育树；用ProtParam程序(http：//expasy.org/cgi-bin/protparam)预测LrNAC转录因子蛋白的分子质量和等电点；根据SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析LrNAC转录因子蛋白的信号肽；用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行蛋白质的跨膜结构域分析；据ProtScale (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl )分析蛋白质的亲水性。根据Motif Scan(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN/)研究蛋白 motifs。

1.2.4LrNAC转录因子基因的器官特异性分析 根据已获得的岷江百合LrNAC转录因子基因序列设计合成定量的引物，LrNAC-1：5′-ACTCCAAGT-GCGTCAAAAGGGC-3′，LrNAC-2:5′-CCTAACC-CTTCCGTCCACATTGA-3′；以18S rRNA(GenBank登录号：D29775.1)为内参基因，其引物为18S rRNA-1：5′-CATAAACGATGCCGACCAGGGA-3′，18S rRNA-2:5′-GTTTCAGCCTTGCGACCAT-ACTCC-3′。分别取岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根等器官的总RNA各1 μg，反转录为cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time)(TaKaRa，Japan)的说明书进行实时荧光定量,在IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，USA)上检测不同器官中该基因的相对表达量，每个样品设3次重复。PCR 扩增程序为：95 ℃变性1 min；95 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环。用Excel 2007和Origin 7.5对数据进行计算和处理，定量数据的处理方法采用2-ΔΔCT法。

1.2.5 CMV侵染后岷江百合LrNAC转录因子基因的表达模式 分别取CMV处理后不同时间的岷江百合叶片总RNA 各1 μg进行表达模式分析，具体操作方法同1.2.4节。

2 结果与分析

2.1 岷江百合LrNAC转录因子基因全长cDNA序列的获得

通过RACE扩增，得到长度为568 bp的3′cDNA序列和长度为365 bp的5′cDNA序列(图1)，序列拼接后获得827 bp的全长岷江百合LrNAC转录因子基因cDNA。

岷江百合LrNAC转录因子基因开放阅读框(open reading frame，ORF)长627 bp，编码208个氨基酸。将该转录因子基因命名为LrNAC,其核苷酸序列和推导的氨基酸序列如图2所示。

2.2 岷江百合LrNAC转录因子基因的生物信息学分析

经ProtParam预测LrNAC蛋白的分子质量为23.4 ku,等电点为9.48，该蛋白为碱性蛋白。利用SignalP 4.1 Server分析可知，该序列无信号肽，为非分泌蛋白。通过ProtScale分析表明，LrNAC蛋白为亲水性蛋白，其亲水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸含量。经TMHMM预测该蛋白不具跨膜区。通过NCBI的protein blast分析显示，LrNAC蛋白具有NAM结构域(图3),该结构域属于NAC转录因子家族中的保守结构域。

通过Motif Scan分析表明，LrNAC蛋白含有1个酰胺化位点(第181-184位氨基酸)、1个N-糖基化位点(第114-117位氨基酸)、2个依赖于 cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点(第145-148、183-186位氨基酸)、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(第24-27、116-119、148-151和205-208位氨基酸)、3个N-豆蔻酰化位点(第62-67、100-105和185-190位氨基酸)和6个蛋白激酶 C 磷酸化位点(第34-36、72-74、92-94、105-107、135-137和186-188位氨基酸)，这说明该蛋白可能存在多种翻译后水平的调控作用，以此来调控自身的表达情况。该编码蛋白第15-163位氨基酸具有NAC家族保守结构域。

氨基酸序列比对结果如图4所示。由图4可以看出，LrNAC蛋白与其他植物中的NAC蛋白同源性均不是很高，其中与欧洲油菜(Brassicanapus，AFI56995.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002264588.1)中NAC蛋白的同源性为50%，与蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_003620957.1)、毛果杨(Populustrichocarpa，IPR003441)中NAC蛋白的同源性为49%，而与水稻(Oryzasativa，AAT02360.1)、马铃薯(Solanumtuberosum，CAC42087.1)、辣椒(Capsicumannuum，AAW48094.1)、小麦(Triticumaestivum，ADD10666.1)中NAC蛋白的同源性均低于40%。从图4还可以看出，所有植物的NAC氨基酸序列在N端NAC结构域区高度保守，在C端转录调控区高度变异，这与NAC转录因子的特点相符[15]。

由图5可以看出，LrNAC蛋白与拟南芥、陆地棉、蒺藜苜蓿中NAC蛋白的亲缘关系相对近些，而与水稻、马铃薯、辣椒、小麦中抗病原菌相关的NAC蛋白的亲缘关系均较远，这与以上NAC氨基酸序列的同源性比对结果一致。

2.3 LrNAC转录因子基因在岷江百合不同器官中的表达

由图6可以看出，LrNAC转录因子基因在岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根中的相对表达量均不相同，其中在嫩叶中的相对表达量最高，在嫩茎中的相对表达量最低。说明LrNAC转录因子基因在岷江百合中存在组成型表达。

2.4 CMV侵染后百合中LrNAC转录因子基因的表达模式

由图7可见，CMV侵染3种百合后LrNAC转录因子基因的相对表达量均明显升高，在岷江百合、卷丹和宜昌百合中，LrNAC转录因子基因的相对表达量达到最大值的时间分别为CMV处理后4 d、3 d和4 d，相对表达量的最大值分别为CMV处理前的38倍、3倍和13倍。由此可以看出CMV可以诱导百合LrNAC转录因子基因的显著表达，说明该基因可能在岷江百合抗黄瓜花叶病毒防御过程中发挥作用。已知植物可通过水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)等多种抗病信号传导途径，并借助NAC转录因子的调控来活化一大批防卫反应基因的协同表达,从而激活植物的抗病防卫反应[21]。植物抗病分子机制的复杂性导致了不同品种百合中LrNAC转录因子基因表达量的变化。

3 结论与讨论

本研究中LrNAC蛋白与其他植物中的NAC蛋白同源性均低于50%，虽然同源性较低，但是利用Motif Scan分析可知，该蛋白具有NAC家族保守结构域，因此可以确定本研究中克隆到的岷江百合中的新基因LrNAC是一个NAC转录因子基因。LrNAC蛋白与水稻、马铃薯、辣椒、小麦中4种抗病原菌相关的NAC蛋白[22，26-28]同源性均低于40%，亲缘关系也较远，虽然已有研究证实结构相似的NAC转录因子有可能行使相似的生物学功能[9]，但不能简单地根据同源性低或亲缘关系远来否定LrNAC转录因子基因在岷江百合抗病毒中的作用。本研究测定了CMV侵染后该基因的表达模式，以此来分析其与岷江百合抗病毒的关系。

植物的抗病毒机制是由结构抗病毒机制和生化抗病毒机制共同作用的。王仙芝[7]的研究表明，复合接种CMV和LMoV后岷江百合对2种病毒均表现为高抗，但其对病毒传播媒介蚜虫却高感；接种初期岷江百合易感染病毒，但后期病毒在体内的增长量很小,由此说明岷江百合的结构抗病毒能力极弱，而生化抗病毒能力很强。后期本课题组对岷江百合中的LrPR10基因进行了克隆并分析了CMV侵染后该基因的表达模式，结果表明与抗性不同的其他种相比岷江百合该基因的表达量和表达时间均表现出很明显的差异(结果尚未发表)，这就更加有力地证明了岷江百合中存在着特殊的生化抗病毒机制。

本研究中，CMV接种3种不同抗性的百合叶片后，LrNAC转录因子基因均上调表达，岷江百合中该基因表达量的最大值为处理前的38倍，而抗性不同的卷丹和宜昌百合仅为岷江百合的8%和34%；岷江百合中该基因达到最大值的时间是处理后第4天,而卷丹和宜昌百合分别为处理后3 d和4 d，结果表明LrNAC转录因子基因参与了岷江百合特殊的生化抗病毒机制，它与LrPR10基因共同在岷江百合的抗病毒过程中发挥着作用。

黄瓜花叶病毒诱导的岷江百合中LrNAC转录因子基因的克隆及表达分析结果表明，LrNAC转录因子基因在岷江百合特殊的生化抗病毒机制中发挥了作用，从而提高了岷江百合抗病毒的机能，但LrNAC转录因子基因的具体作用机制尚不清楚，还需进一步的研究。

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Cloning and expression analysis ofLrNACtranscription factor gene fromLiliumregaleinduced by cucumber mosaic virus

ZHANG Xiang-ling,LUO Jian-rang,ZHANG Yan-long,NIU Li-xin, SUN Dao-yang,LIANG Zhen-xu

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated disease resistance mechanism ofLiliumregaleagainst cucumber mosaic virus (CMV) to improve breeding of antiviral lily.【Method】 Leaves ofL.regalewere treated by CMV and RACE technology was performed to clone the full length of NAC transcription factor gene (LrNAC).The obtained cDNA sequence was analyzed using bioinformatics methods.Real-time PCR was used to assess the expression ofLrNACtranscription factor gene in different organs ofL.regaleand the expression pattern was analyzed.【Result】 The full cDNA ofLrNACtranscription factor gene was 827 bp and it encoded a 208-amino acid peptide with a conserved domain of NAC transcription factor family.The protein without across the membrane was basic,hydrophilic and not secretory.The deduced sequence of amino acids ofLrNAChad a calculated molecular weight of 23.4 ku with a pI of 9.48.The relative expression level of this gene was highest in tender leaves,while lowest in tender stems.LrNACtranscription factor gene was up-regulated by CMV.After being inoculated by CMV,this gene peaked on 4 d,3 d and 4 d inL.regale,L.lancifoliumandL.leucanthum,respectively and the maximum expression values of treated samples were 38,3 and 13 times larger than the untreated ones. 【Conclusion】LrNACtranscription factor gene played a role inL.regaleagainst CMV.

Liliumregale;cucumber mosaic virus (CMV);LrNACtranscription factor gene;RACE;gene expression

2013-12-26

国家高技术研究发展计划(863计划)子项目(2011AA1008)

张响玲(1988-)，女，山东烟台人，硕士，主要从事百合病毒病研究。E-mail:zxlzhangxiangling@163.com

罗建让(1978-)，男，陕西宝鸡人，讲师，博士，主要从事园林植物资源评价和育种研究。 E-mail：luojianrang@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.030

S682.2+65

A

1671-9387(2015)06-0052-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.030.html