脂联素基因在荷斯坦公牛不同组织部位的表达差异

张长庆，刘 婷，赵生国，雷赵民，王欣荣，孙国虎，李世歌，李耀东，吴建平

(甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

脂联素基因在荷斯坦公牛不同组织部位的表达差异

张长庆，刘 婷，赵生国，雷赵民，王欣荣，孙国虎，李世歌，李耀东，吴建平

(甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070)

【目的】 研究脂联素基因在荷斯坦公牛不同组织及月龄间的相对表达差异性，为脂联素基因作为荷斯坦公牛育肥指标的分子辅助标记提供依据。【方法】 运用实时荧光定量PCR法检测了脂联素基因在15和17月龄荷斯坦公牛脂肪组织(背部脂肪、腰部脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪)和肌肉组织(背最长肌和半腱肌)间的相对表达差异性。【结果】 15月龄时脂联素基因在荷斯坦公牛肾周脂肪和肠系膜脂肪中的相对表达量极显著高于腰部脂肪、背部脂肪、背最长肌和半腱肌(P<0.01)，17月龄时仅显著高于背最长肌和半腱肌(P<0.05)；17月龄时该基因在背部脂肪中的相对表达量显著高于15月龄时(P<0.05)。【结论】 脂联素基因在15和17月龄荷斯坦公牛脂肪组织和肌肉组织中均有表达，且在脂肪组织和肌肉组织间具有组织表达差异性。

脂联素基因；荷斯坦公牛；不同组织部位；表达差异

脂联素(adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，又被称为 ACRP30、ADIPOQ、APM1或 GBP28。目前，对小鼠[1]和人[2-3]脂联素基因结构及小鼠[4]、鸡[5]、鸭[6]和猪[7]等物种的脂联素基因的表达研究认为，脂联素具有多种生理功能，它参与血脂血糖代谢、炎症等病理生理过程，在代谢综合症及拮抗动脉粥样硬化等方面都具有重要作用；在临床上它与肥胖、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病及心血管疾病等密切相关[8-11]。牛脂联素基因定位于第1号染色体上，由3个外显子和2个内含子构成，全长11 779 bp，其中cDNA长度为720 bp，编码240个氨基酸[12]。研究表明脂联素参与了牛脂肪代谢的调节[13]。丛立新等[14]曾从牛脂肪组织中提取总RNA，成功克隆了牛脂联素全基因671 bp cDNA。在对夏洛莱牛×红安格斯牛和海福特牛×亚伯丁安格斯牛的研究中发现，脂联素基因的特异表达与其背膘厚度具有一定的相关性[15]。但目前对牛脂联素基因在不同组织部位的表达研究较少。本研究利用实时荧光定量PCR法，对荷斯坦公牛不同组织部位脂联素基因的相对表达量进行了研究，为脂联素基因作为荷斯坦公牛育肥指标的分子辅助标记提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取6头同胎次体质量相近的荷斯坦公犊牛，在同一饲养条件下育肥至15 和17月龄时(育肥条件下，15和17月龄时荷斯坦公牛平均活体质量分别为500和550 kg/头，达到适宜出栏的体质量)各屠宰3头，屠宰剥皮后立即采集脂肪组织(背部脂肪、腰部脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪)和肌肉组织(背最长肌(12～13肋骨间)和半腱肌)，放入液氮罐中速冻，带回实验室后于-70 ℃冰箱保存备用。所有样品均在牛屠宰剥皮后15 min内采集，除肠系膜脂肪外，其他组织样品均采自左半胴体。

1.2 总RNA的提取

参照RNAiso Plus(Total RNA extraction reagent)的RNA提取步骤分别提取牛各组织样品中的总RNA，每头牛各组织部位样品提取1份总RNA，并利用Implen超微量紫外可见分光光度计(NanoPhotometer)测定总 RNA 浓度和纯度，其完整性以琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 cDNA 的合成

1.3.1 总RNA中少量基因组 DNA污染的去除 基因组DNA去除反应的反应液需在冰上准备。反应液为：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，总RNA(使加入的总RNA量达到1 μg)，RNase Free dH2O补齐到10.0 μL。反应程序：42 ℃ 2 min；4 ℃保存备用。

1.3.2 反转录反应 在冰上准备反应液：DNA去除反应混合液 10.0 μL，5×PrimeScript Buffer2(for Real Time) 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，合计 20.0 μL。反应程序：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保存。反应结束后将合成的cDNA稀释至100 μL，即终质量浓度相当于 10 ng/μL 总 RNA，-20 ℃保存备用。cDNA 的合成反应均在普通PCR仪上进行。

1.4 引物设计与内参基因的选择

根据脂联素基因mRNA序列(GenBank登录号NM_004797)，利用Primer3s设计脂联素基因引物序列， F：5′-GATCCAGGTCTTGTTGGTCCTA-A-3′，R：5′-GAGCGGTATACATAGGCACTTTC-TC-3′，产物预期长度131 bp，退火温度61.1 ℃。参照Duckett等[16]设计的GAPDH引物序列，F：5′-GGGTCATCATCTCTGCACCT-3′，R：5′-GGTCT-AAGTCCCTCCACGA-3′，产物预期长度176 bp，退火温度59.8 ℃。将GAPDH基因作为实时荧光定量PCR的内参基因。引物均由赛百盛生物技术有限公司合成。

1.5 实时荧光定量PCR

利用 SYBR Premix ExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus)试剂盒进行实时荧光定量PCR。PCR 反应体系包括：SYBR Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL，稀释的cDNA 模板(<100 ng)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，dH2O(灭菌蒸馏水)补齐到20 μL。 PCR反应在LightCycler 480 System Real Time PCR扩增仪上完成。PCR 反应程序为：95 ℃ 30 s(升温速率4.4 ℃/s)，1 cycle；95 ℃ 5 s (升温速率4.4 ℃/s)，60 ℃ 30 s (升温速率2.2 ℃/s，Acquisition Mode:Single)，40 cycles；95 ℃ 5 s (升温速率4.4 ℃/s) ，60 ℃ 1 min (升温速率2.2 ℃/s)，95 ℃ 0 s(升温速率0.11 ℃/s,Acquisition Mode:Continuous,Acquisitions:5/℃)，1 cycle； 50 ℃ 30 s (升温速率2.2 ℃/s) ，1 cycle 。每个样品重复3次。每对引物分别设立3个内参基因不含模板的阴性对照。

1.6 数据分析

运用SPSS 17.0软件对脂联素基因在荷斯坦公牛同月龄不同组织部位及不同月龄同一组织部位的相对表达量进行统计分析，采用LSD法和Duncans法对各部位的相对表达差异性进行检验，结果均表示为“平均值±SD”。

2 结果与分析

2.1 牛RNA提取结果检测

RNA 提取结果是决定实时荧光定量PCR 成败的关键。电泳检测结果(图1)显示，荷斯坦公牛各组织部位样品的RNA均可见清晰的2条带(28S rRNA、18S rRNA)，其条带亮度比值均大于3∶1，表明提取的总RNA未出现降解。用超微量紫外可见分光光度计定量，OD260/OD280值均在1.82～2.04，说明提取的总RNA纯度较高，可以用于后续的反转录及实时荧光定量PCR。

2.2 牛脂联素基因RT-PCR扩增产物检测

以荷斯坦公牛不同组织部位的总RNA为模板，以设计的引物分别对脂联素基因和GAPDH基因进行RT-PCR扩增，扩增产物用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得大小约131和176 bp的条带(图2)，与预期目的片段和内参基因片段大小基本相符。

2.3 脂联素基因在牛组织间的相对表达

通过实时荧光定量PCR对荷斯坦公牛背部脂肪、腰部脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪、背最长肌、半腱肌等6个脂肪和肌肉组织部位中脂联素基因的mRNA相对表达量进行测定，结果见表1。由表1可以看出，脂联素基因在15和17月龄荷斯坦公牛的不同组织部位均存在不同程度的表达。在15月龄荷斯坦公牛不同脂肪和肌肉组织中，其相对表达量由高到低依次为：肾周脂肪、肠系膜脂肪、腰部脂肪、背部脂肪、背最长肌、半腱肌，且肾周脂肪和肠系膜脂肪相对表达量极显著高于背部脂肪、腰部脂肪、背最长肌和半腱肌(P<0.01)；而在17月龄荷斯坦公牛不同脂肪和肌肉组织中，其相对表达量由高到低依次为：肠系膜脂肪、肾周脂肪、背部脂肪、腰部脂肪、背最长肌、半腱肌，且肠系膜脂肪和肾周脂肪相对表达量显著高于背最长肌和半腱肌(P<0.05)。对于同一组织部位，脂联素基因的相对表达量随着年龄变化而不同，在背部脂肪中该基因的相对表达量17月龄显著高于15月龄(P<0.05)。

注：同列不同大写字母表示同月龄不同组织部位差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示同月龄不同组织部位差异显著(P<0.05)；“*”表示同一组织部位不同月龄差异显著(P<0.05)。

Note:Different uppercase and lowercase letters indicate highly significant difference (P<0.01) and significant difference(P<0.05) among different tissues at each age,respectively;“*” shows significant difference (P<0.05) between different ages in each tissue.

3 讨 论

脂联素是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之一，受到激素水平的调控，可以调节脂肪代谢，是机体脂质代谢调控网络中的重要调节因子[17-18]，它以内分泌方式循环于血液中，参与调节葡萄糖、脂肪酸代谢及抵抗炎症反应等生命活动[19]。近年来，大量研究发现，脂联素及脂联素基因与人类代谢综合症、肥胖综合症、动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、胰岛素抵抗等许多疾病有着较为密切的关系[8-11]。

研究表明脂联素是迄今为止所发现的唯一一个与肥胖呈负相关的细胞因子[20]，肥胖症患者血浆脂联素水平较正常人有所下降，提示脂联素参与了脂肪代谢的调节[14]。张辉等[21]通过对荷斯坦新生犊牛前脂肪细胞体外单层贴壁培养的研究表明，脂联素基因在荷斯坦犊牛前脂肪细胞不同培养时期均有不同程度的表达，而且随着前脂肪细胞分化成熟脂肪细胞内甘油三酯的逐渐蓄积，脂联素基因 mRNA 水平也逐渐升高，到第 12天时表达最高，说明脂联素基因的表达可能与脂肪细胞的分化和脂质积聚有着密切的关系。张辉等[22]研究发现，延边黄牛脂肪组织脂联素基因 mRNA 水平与肌肉脂肪含量呈正相关关系(P<0.001)，验证了之前的研究结果，二者一致表明脂联素基因可能通过调节脂肪细胞分化及影响肌内脂肪含量而影响胴体性状。研究证明脂肪细胞是诱导脂联素基因表达的必须组织[23]，小鼠和大鼠的脂联素基因高度特异地表达于脂肪组织。Wang等[24]研究发现，猪脂联素基因在脂肪组织细胞中表达丰富；Dai等[25]半定量RT-PCR研究表明，猪脂联素基因mRNA特异表达于脂肪组织；Maddineni等[26]、Yuan等[5]研究表明，鸡脂联素基因在脂肪组织中表达量最高；薛茂云等[6]对鸭脂联素基因在不同组织中表达差异的研究显示，该基因在脂肪组织的表达最高。本研究结果显示，脂联素基因在同月龄荷斯坦公牛的不同组织部位均有不同程度的表达，15月龄时，脂联素基因的相对表达在肾周脂肪组织最高，而在半腱肌极低，总体来看该基因在肾周脂肪组织和肠系膜脂肪组织的相对表达量极显著高于其他组织部位(P<0.01)；17月龄时，脂联素基因的相对表达量在肠系膜脂肪组织最高，而在半腱肌依然很低，显然该基因在半腱肌和背最长肌的相对表达量显著低于其他脂肪组织部位(P<0.05)。这一结果与上述诸多研究结果一致，由此推断脂联素基因在荷斯坦公牛脂肪组织中的相对表达量显著高于肌肉组织。

有研究表明，在饲喂同一能量水平日粮时，延边黄牛脂肪组织脂联素基因mRNA水平有随着育肥日龄增加而增加的趋势[22]。而本研究结果显示，在17月龄时荷斯坦公牛背部脂肪组织、腰部脂肪组织、肠系膜脂肪组织和半腱肌脂联素基因的相对表达量较15月龄均有升高，且在背部脂肪组织17月龄显著高于15月龄(P<0.05)，这与上述研究结果一致，但在肾周脂肪组织和背最长肌17月龄低于15月龄，与上述研究结果有差异。在人[18]和小鼠[27]的研究中发现，当脂肪过度沉积时，脂肪组织中脂联素基因的表达量降低；肉牛皮下脂肪的生长发育与脂联素基因的表达具有负相关性[15]，而且在牛体躯脂肪组织生长中肾周脂肪与腹腔和盆腔脂肪的生长先于肌肉间脂肪、皮下脂肪和肌肉内脂肪[28]，由此断定17月龄时肾周脂肪可能已大量沉积，也进一步说明脂联素在调节脂肪沉积过程中具有一定作用。

曾有研究者将脂联素基因作为猪脂肪沉积的候选基因，对其进行多态性研究，结果发现脂联素基因的多态性与猪脂肪沉积及胴体性状相关[25,29]。研究还发现，脂联素基因的基因型与波尔山羊的生长性状具有一定相关性[30]。Morsci等[31]研究证实，在安格斯牛脂联素基因座(位于安格斯牛BTA1上)附近的数量性状位点(QTL)影响着牛肉的大理石纹、眼肌面积和脂肪厚度。本研究中，脂联素基因在所检测的组织部位均有不同程度的表达，从15月龄到17月龄，脂联素基因的相对表达量在背最长肌和肾周脂肪组织下降，而在其他组织部位上升，且在背部脂肪组织17月龄显著高于15月龄(P<0.05)。这些变化必然与各组织部位脂联素水平的变化有着密切的关系，脂联素又是脂肪细胞所分泌的一种蛋白因子，所以这些变化也在不同程度上反映了荷斯坦公牛在育肥过程中体躯脂肪的生长发育变化。

杨彦杰等[12]研究发现，脂联素基因与秦川牛胸围、眼肌面积、背膘厚、胴体腿臀围等育肥指标密切相关，推断该基因可以作为影响秦川牛产肉性状的候选基因而用于秦川牛新品系的辅助选择。Shin等[32]研究发现，脂联素基因单核苷酸多态性对朝鲜牛的背膘厚度和眼肌面积有显著影响，由此推断该基因可作为朝鲜牛胴体性状选择的有效分子标记。作为唯一随脂肪含量的增加而表达下降的脂肪因子，脂联素在脂肪生长发育及代谢中的作用还有待于更深入的研究，脂联素基因也将有望成为影响肉牛胴体性状的分子标记并在肉牛育肥选育中发挥重要作用。

本研究只是初步探讨了脂联素基因在荷斯坦公牛不同月龄、不同组织的表达差异性规律，本课题组还将对血液生化指标进行检测，并对荷斯坦牛肌肉和脂肪组织的生长发育进行分析，进一步探讨脂联素基因在牛肌肉和脂肪生长发育及代谢中的作用机制，并对该基因对牛胴体性状的影响进行总结，以期推广应用于生产实践。

4 结 论

(1)脂联素基因在15和17月龄荷斯坦公牛的脂肪组织(背部脂肪、腰部脂肪、肠系膜脂肪、肾周脂肪)和肌肉组织(背最长肌、半腱肌)均有不同程度的表达，且脂肪组织与肌肉组织间具有表达差异性。

(2)在同一组织部位脂联素基因的相对表达量随着月龄变化而不同，尤其在背部脂肪组织差异最大。

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Expression differences ofADIPOQgene in different tissues of Holstein bull

ZHANG Chang-qing,LIU Ting,ZHAO Sheng-guo,LEI Zhao-min,WANG Xin-rong,SUN Guo-hu,LI Shi-ge,LI Yao-dong,WU Jian-ping

(FacultyofAnimalSci-Tech,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China)

【Objective】 The objective of this study was to compare the expressions of adiponectin (ADIPOQ) gene in different tissues of Holstein bulls at different ages.【Method】 Real-time fluorescent quantitative PCR was used to determine the relative expression ofADIPOQgene using RNA isolated from different adipose tissues (subcutaneous fat over sirloin,subcutaneous fat over rib,kidney fat,and mesenteric fat) and muscle tissues (longissimus dorsi and semitendinosus) of Holstein bulls with two different ages (15 and 17 months).【Result】 Expressions ofADIPOQin kidney fat and mesenteric fat were greater (P<0.01) than in subcutaneous sirloin fat,subcutaneous rib fat,longissimus dorsi and semitendinosus in 15 month group and greater(P<0.05)than in longissimus dorsi and semitendinosus in 17 month group.Expressions ofADIPOQgene also differed between 15 month and 17 month old Holstein bulls in the same adipose tissues.The expressions in subcutaneous rib fat in 17 month group were greater (P<0.05) than in 15 month group.【Conclusion】 Expressions ofADIPOQgene in different tissues of Holstein bulls with ages of 15 month and 17 month differed.These results suggested that evaluation of expressions ofADIPOQgene should consider the age as well as the tissue.

ADIPOQgene;Holstein bulls;different tissues;differential expression

2013-09-29

兰州市科技局农业科技专项(2011-1-10)；甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2010-04，GNSW-2011-27)

张长庆(1986-)，男，甘肃武威人，在读硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖学研究。E-mail：836025862@qq.com

吴建平(1960-)，男，甘肃定西人，教授，博士，博士生导师，主要从事动物遗传育种、家畜生产体系研究。 E-mail:wujp@gsau.edu.cn

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.030

S823.2

A

1671-9387(2015)01-0031-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.030.html