麦洼牦牛TLR1基因组织表达分析

陈亚冰，兰道亮，黄 勇，林宝山，黄 偲，李 键

(西南民族大学 a 生命科学与技术学院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

麦洼牦牛TLR1基因组织表达分析

陈亚冰a，兰道亮b，黄 勇a，林宝山a，黄 偲a，李 键b

(西南民族大学 a 生命科学与技术学院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

【目的】 建立一种牦牛TLR1基因表达量的荧光定量PCR检测方法，并分析TLR1基因在牦牛不同组织中的表达差异。【方法】 参考牦牛TLR1基因序列，在其保守区设计特异性引物，并以牦牛β-actin基因为内参基因建立荧光定量方法；基于该荧光定量方法分析TLR1基因在牦牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、乳腺、肌肉、卵巢11种组织中的表达水平。【结果】TLR1基因和β-actin基因扩增产物电泳结果呈现单一条带，其产物熔解曲线均为特异的单峰，表明引物具有较高的特异性。组织表达结果显示，TLR1基因在所检测的牦牛11个组织样本中均有表达，其中在肾、肝、脾、肺、卵巢、小肠中表达量较高，在胃、乳腺、心、大肠、肌肉组织中表达量较低。【结论】TLR1基因在牦牛各组织中转录水平差异较大，这可能与各组织对病原体的识别和抵抗能力有关。

麦洼牦牛；TLR1；荧光定量PCR；组织表达谱

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为一种重要的模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)，能够识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，在天然免疫系统、感染和炎症期间可作为“哨兵”在检测微生物配基中发挥重要的作用，另外TLRs能够向抗原递呈细胞发出警报，从而启动获得性免疫系统，是连接天然免疫和获得性免疫反应的桥梁[1-6]。迄今共发现11种人的TLR和13种小鼠TLR，每种TLR成员都能够识别特异的微生物病原体PAMP。作为TLRs家族的成员，TLR1能够与TLR2形成异源二聚体，从而协助识别革兰氏阳性及阴性细菌细胞壁，并增强对PAMPs的特异性识别， 因此TLR1基因也被认为是奶牛乳房炎易感性候选基因[7-9]。

TLRs在不同组织中的表达水平直接影响其对入侵该组织病原体的识别作用。目前，荧光定量技术已被用于检测TLRs在人、小鼠、猪、羊等多个物种组织中的表达[10-13]，但利用荧光定量PCR方法分析TLRs 在牦牛不同组织中表达量的研究尚未见报道。牦牛是世代生活在高原环境下的特殊物种，其机体早已适应了高原的低氧、严寒等恶劣环境。对牦牛的抗病分子机制进行研究，一方面可以深入理解高原动物特有的免疫机制，另一方面也可为牦牛的抗病育种提供理论依据。本研究利用荧光定量PCR方法检测了牦牛体内TLR1基因在不同组织中的表达水平，以期为牦牛的免疫机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物 本试验所用麦洼牦牛母牛来自甘南藏族自治州夏河县，共5头。采集5头母牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺11种组织样本，放入液氮中送回实验室保存。

1.1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪及普通PCR仪，均为Bio-Rad公司产品；Trizol购自Invitrogen公司；反转录酶及SYBR Premix ExTaqTMⅡ试剂盒，均购自Takara公司。

1.1.3 引物设计与合成 根据本课题组前期研究获得的牦牛TLR1基因全长序列(GenBank:KJ101605.1)及定量引物设计原则设计荧光定量引物，引物序列见表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 组织RNA的提取及cDNA的合成

称取约200 mg牦牛组织样品置于研钵中，加入液氮进行研磨，当组织样品被研磨成粉末状后，加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化。吸取1 mL样品至无RNA酶的离心管中，加入200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min，4 ℃下13 000g离心15 min；小心吸取500 μL上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，4 ℃下13 000g离心10 min；弃上清，沉淀加入1 mL 体积分数为75%的乙醇洗涤，4 ℃下13 000g离心5 min；弃上清，室温干燥沉淀，加入30 μL DEPC水溶解RNA。RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳结果是否具有3条清晰带(28S、18S及5.5S 3条带)判定RNA完整性。利用紫外分光光度计测定RNA溶液的浓度及纯度，分别在230,260和280 nm下测定吸光度(OD230、OD260、OD280)，计算OD260/OD280和OD260/OD230值。若RNA样品的OD260/OD280值为1.8～2.0，且OD260/OD230值为2.0左右，说明提取的RNA纯度较高，适宜进行下一步试验。RNA浓度测定后，取2 μg RNA合成cDNA。RNA需要首先进行DNA去除处理，反应体系为10 μL，其中5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL,gDNA Eraser 1 μL,RNA 2 μg,RNase Free dH2O补足到10 μL。该混合液42 ℃处理 2 min即去除了RNA溶液内的DNA并得到反应液1。将去除DNA的RNA反转录成cDNA,反转录体系为20 μL：反应液1 10 μL ,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL,Primer Mix 1.0 μL,5× PrimeScript Buffer2 4.0 μL,RNase Free dH2O 4.0 μL。按以下程序进行反转录反应：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s，生成的cDNA于-20 ℃保存备用。

1.3 引物特异性的鉴定

以牦牛脾脏组织cDNA为模板，首先进行普通PCR反应，根据条带是否单一来初步判断引物的特异性。扩增体系为25 μL，其中2×TaqMaster Mix 12.5 μL，dH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL。扩增程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，用Axygen凝胶回收试剂盒回收纯化目的产物。将PCR产物连接pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，在含有100 μg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上涂板，37 ℃培养后挑选单菌落，通过菌液PCR鉴定的阳性克隆进行测序分析并提取阳性重组质粒。将测序结果与目的基因进行同源性比对，判断扩增片段的正确性。以牦牛组织样本cDNA为模板进行实时定量PCR，根据扩增产物熔解曲线是否单一来检测引物的特异性。荧光定量PCR反应体系为15 μL：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 7.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR扩增程序如下： 95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，39个循环。熔解曲线分析：95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,然后以每10 s 0.5 ℃的速率从60 ℃缓慢升温到95 ℃。

1.4 TLR1和β-actin基因标准曲线的建立

提取TLR1和β-actin基因的阳性菌液质粒，利用紫外分光光度计测定各质粒质量浓度，并计算其含量(拷贝/μL)。将质粒进行稀释，使质粒含量为 1×101～1×1010拷贝/μL。以不同含量质粒为模板进行定量PCR反应，最后以质粒含量的常用对数值为横坐标，以对应的循环阈值(Ct)为纵坐标构建标准曲线。

1.5 TLR1基因在牦牛各组织中的表达

分别以5头母牦牛11种组织cDNA为模板进行定量PCR反应，采用Pfaffl method，以小肠基因表达量为对照，计算TLR1基因在其他各组织的相对表达量，同时应用SPSS 18.0软件计算重复样品之间Ct均值以及标准偏差，最后使用Excel制图功能绘制出基因在牦牛各组织中的相对表达柱状图。

2 结果与分析

2.1 牦牛RNA质量的检测

提取的牦牛总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，可明显看到28S、18S及5.5S rRNA 3条带(图1)，说明提取的 RNA具有较高的完整性，无降解。紫外分光光度计检测结果表明，OD260/OD280为1.8～2.0，说明提取的RNA纯度较高，可用于反转录及后续定量试验。

2.2 TLR1和β-actin基因引物特异性检验

普通PCR反应被用于初步判定引物的特异性，结果显示基因扩增片段大小和预测结果一致(图2)。TLR1基因扩增片段测序结果与牦牛TLR1基因(GenBank:KJ101605.1)同源性为100%，β-actin基因扩增片段测序结果与牦牛β-actin基因(GenBank:NM_173979.3)同源性为100%，表明引物扩增片段正确。

TLR1及β-actin基因的熔解曲线见图3和图4。由图3和图4可以看出，β-actin基因在熔解温度为(82±0.5) ℃、TLR1基因在熔解温度为(82.5±0.5) ℃时出现特异性单峰，表明该引物特异性良好。

2.3 TLR1和β-actin基因标准曲线的建立

当质粒含量为102～107拷贝/μL时，β-actin基因扩增效率达到了95.4%，相关系数为0.999(图5)；质粒含量为101～108拷贝/μL时，TLR1基因扩增效率达到了100.4%，相关系数为0.999(图6)。

2.4 TLR1基因在牦牛组织中的表达分布

以β-actin基因作为内参基因，以小肠基因表达量为对照，分析TLR1基因在牦牛其他10种组织中的相对表达量，结果见图7。

图7 牦牛TLR1基因组织表达谱
Fig.7 Expression ofTLR1 gene in yak

图7结果显示，TLR1基因在所检测的牦牛11个组织样本中均有表达，其中在肾、肝、脾、肺、卵巢的相对表达量较高，在胃、乳腺、心、大肠、肌肉组织中的相对表达量较低。

3 讨 论

TLRs作为一种模式识别受体，不仅在天然免疫中起重要作用，同时也是天然免疫和获得性免疫的连接点，可以介导获得性免疫应答[14]。对TLRs的研究可以帮助理解动物病原体被识别的本质，为阐明天然免疫机制及寻找由于免疫失调所致疾病的治疗提供新的思路。牦牛是青藏高原上的一个特有物种，其机体可能存在特殊的抗病免疫机制。本课题组前期工作发现，牦牛TLR1基因与其他平原哺乳动物相应基因具有较高的同源性，因此比较牦牛组织表达模式差异将是下一步重点研究内容。本试验采用SYBR Green I荧光嵌合染料方法检测了牦牛体内TLR1基因转录水平，SYBR Green I能够与任何一种双链DNA结合而发出荧光，其PCR反应特异性取决于扩增引物的特异性。熔解曲线结果显示，扩增产物呈特异性良好的单峰，没有其他杂峰，测序结果证明扩增产物为TLR1基因,证明引物的特异性良好。另外，本试验采用相对定量方法，通过内参β-actin基因来校准TLR1基因mRNA表达量，这既保证了数据的准确性又提高了试验效率。研究发现TLR1基因组织分布比较广泛[12-15]，这与本试验结果相符合。TLR1的主要功能是协助TLR2增强对PAMPs的识别能力，TLR2与TLR1形成的异源二聚体可识别分枝杆菌三酰脂蛋白，并能够增强对PAMPs的特异性识别，因此TLR1也被认为是乳房炎易感性候选基因。本试验结果发现，TLR1基因在乳腺组织中的相对表达量较低，这可能与试验动物机体未患乳房炎有关。Vahanan等[15]检测发现，TLR1基因在水牛肝脏、肺脏、脾脏、心脏中表达量较高，而在肾脏、卵巢中的表达量较低或者不表达。本研究发现，TLR1基因在牦牛肝、肺、脾表达量较大，这与Vahanan等[15]的研究结果相符合；而TLR1基因在牦牛肾脏和卵巢中的表达量也较高，这可能与牦牛局部组织免疫相关。赵一萍等[16]对TLR1基因在蒙古马不同组织内的表达进行了分析，发现TLR1基因在蒙古马肺脏组织中表达量最高，同时在心脏、肝脏、脾脏、肾脏等也有表达，这与本研究结果基本符合，并进一步证明了TLR1在不同哺乳动物体内扮演着重要的免疫角色。

关于人和小鼠Toll样受体组织定量的研究较多，并且许多物种的TLRs检测方法已经建立[17-20]，而对牦牛Toll样受体的研究报道相对较少。本试验利用荧光定量PCR技术对牦牛器官及组织TLRs mRNA转录水平进行研究，为下一步研究牦牛机体内TLRs免疫机制奠定了理论基础。当然，仅检测TLRs mRNA转录水平不能完全代表Toll样受体蛋白的表达水平，TLRs在不同组织中的转录水平差异是否影响到蛋白质的表达水平，从而影响TLR1蛋白与下游配体的结合能力，最终影响下游信号转导及细胞因子的释放，还有待进一步研究。同时，本研究下一步将比较分析TLR1基因在牦牛和其他牛中表达量的差异，从而确定TLR1基因在牦牛体内的表达是否存在特异性。

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Expression analysis ofTLR1 gene in different tissues of Maiwa yak

CHEN Ya-binga,LAN Dao-liangb,HUANG Yonga,LIN Bao-shana,HUANG Caia,LI Jianb

(aCollegeofLifeScienceandTechnology,bCollegeofTibetanPlateauResearch,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

【Objective】 The study was designed to establish a real-time PCR assay for detection ofTLR1 gene,and to further analyze the expression pattern in tissues of yaks.【Method】 According to the sequence of yakTLR1 gene,the real-time PCR primers were designed,the real-time PCR was established,and theβ-actingene was chosen to normalize the expression level ofTLR1 gene.The established detection method was used to analyze the expression pattern ofTLR1 gene in different tissues of yak,including heart,liver,spleen,lung,kidney,large intestine,small intestine,stomach,mammary gland,muscle and ovary.【Result】 The electrophoresis results showed that bothTLR1 gene andβ-actingene included a signal band.The melting curve of target product showed that the product was specific to a single peak,suggesting the specificity of primers.Moreover,real-time quantitative PCR assay was established and used to detect the relative expression level ofTLR1 gene in different tissues,and the gene expression level in small intestine was selected as a baseline.The quantitative results showed thatTLR1 gene was expressed at eleven tissues examined.TLR1 gene had high expression levels in kidney,liver,spleen,lung,ovary,small intestine and low levels in stomach,mammary gland,heart,large intestine and muscle.【Conclusion】 There were differences on the transcription levels ofTLR1 mRNA in different tissues,which may be associated with the ability to recognize and defend pathogens for different tissues.

Maiwa yak;TLR1;real-time PCR;expression pattern in tissues

2014-04-18

中央高校青年教师基金项目(2014NZYQN37)

陈亚冰(1989-),男，河南许昌人，硕士，主要从事高原动物免疫分子机制研究。E-mail:cybxc923410296@126.com

李 键(1967-)，男(藏族)，四川理县人，教授，博士，主要从事动物生殖调控研究。E-mail:lijian@swun.cn

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.011

Q786；S823.8+5

A

1671-9387(2015)01-0001-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.011.html