泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌分子流行病学分析

云长缨，吴多荣，黄 会，黄增光，佘姝敏



泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌分子流行病学分析

云长缨，吴多荣，黄 会，黄增光，佘姝敏

目的 了解海南地区泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌的流行特点及耐药机制。方法 收集海南地区4家三级综合医院(海南省人民医院、海口市人民医院、海南农垦总局医院和三亚市人民医院)2012年1月—2013年8月门诊和住院泌尿系感染患者清洁中段尿分离的多重耐药肠杆菌科细菌225株，采用VITEK 2 compact微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验，采用确证试验检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，采用改良Hodge试验(MHT)和金属酶筛选(MBL)试验对碳青霉烯类不敏感菌株进行碳青霉烯酶表型确认，对于阳性菌株采用PCR扩增分别进行ESBLs、KPC酶、IPM酶和NDM-1基因型检测，并对扩增产物进行测序。结果 225株多重耐药肠杆菌科细菌中产ESBLs的细菌203株(90.2%)，其中大肠埃希菌163株、肺炎克雷伯菌32株、产酸克雷伯菌4株、奇异变形杆菌4株；其他多重耐药肠杆菌科细菌22株(9.8%)。药敏试验发现对碳青霉烯类不敏感的细菌有26株，行MHT有11株阳性，MBL试验有8株阳性。经PCR扩增对阳性菌株进行基因检测，结果3株携带KPC-2基因，5株携带NDM-1基因，1株携带IPM-4基因。ESBLs基因型中TEM型占60.1%(122/203)、CTX-M型占46.3%(94/203)、SHV型占15.8%(32/203)，有39株细菌同时扩增出2种及以上基因型。结论 海南地区泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌主要以产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，流行的基因型以TEM型多见，其次是CTX-M型和SHV型；已发现少量对碳青霉烯类不敏感菌株，其主要耐药机制为产生NDM-1、KPC-2、IPM-4基因，临床上应引起重视，严格做好预防和控制工作。

泌尿系疾病；肠杆菌科感染；分子流行病学

云长缨，吴多荣，黄会，等.泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌分子流行病学分析[J].中国全科医学，2015，18(11)：1322-1325，1329.[www.chinagp.net]

Yun CY，Wu DR，Huang H，et al.Urinary system infection of multidrug-resistant enterobacteriaceae:a molecular epidemiology analysis[J].Chinese General Practice，2015，18(11)：1322-1325，1329.

泌尿系感染是临床常见的感染之一[1]，最常见的病原菌是肠杆菌科细菌，其中大肠埃希菌尤为多见[2]。近年来，随着抗菌药物的广泛使用，肠杆菌科细菌的多重耐药现象在临床上已非常多见[3-4]。这给临床泌尿系感染的治疗带来了很大的困难，其主要耐药机制为产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、IPM酶、KPC酶以及NDM-1等多种耐药酶[5]。为全面了解海南地区泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌的分子流行病学特点及耐药机制，现对2012年1月—2013年8月收集的225株多重耐药肠杆菌科细菌的分子流行病学特点回顾分析如下。

1 材料与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：门诊和住院泌尿系感染患者清洁中段尿培养鉴定为肠杆菌科细菌，菌落计数>10万/ml，且大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌药敏结果显示为ESBLs阳性，其他肠道杆菌显示对3类或3类以上抗菌药物耐药。排除标准：同一患者相同部位或不同部位检出相同细菌，只收集第1株细菌纳入研究，不重复收集。

1.2 材料

1.2.1 菌株来源 收集海南地区4家三级综合医院(海南省人民医院、海口市人民医院、海南农垦总局医院和三亚市人民医院)2012年1月—2013年8月门诊和住院泌尿系感染患者清洁中段尿分离的多重耐药肠杆菌科细菌225株，其中男104名，女12名；年龄4个月～95岁。

1.2.2 仪器与试剂 VITEK 2 compact微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)，PCR仪为veriti 96-well thermal cycle(applied biosystems，USA)，电泳仪为powerpac basic(bio-red，USA)，离心机为neofuge 13(healforce,中国)，水浴锅HH-6(江苏金坛荣华仪器制造有限公司)，凝胶成像系统Gel Doc 2000(bio-red，USA)，HWS智能型恒温恒湿培养箱(宁波江南仪器厂)，电泳槽(北京六一仪器厂)。主要试剂：ExTaq Mix与 DNA Marker( D2000) 均购自宝生物工程公司，所有引物由北京六合华大基因有限公司合成，VITEK 2 compact GN鉴定卡和药敏卡购自法国生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌鉴定和药敏试验 所有菌株采用VITEK 2 compact微生物分析仪GN鉴定卡和药敏卡进行鉴定和药敏试验，质控菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)。

1.3.2 ESBLs检测 采用确证试验检测ESBLs，按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)2012年(M100-S22版)推荐的方法进行[6]。

1.3.3 改良Hodge试验(MHT)和金属酶筛选(MBL)试验[7]采用MHT和MBL试验对碳青霉烯类不敏感菌株进行碳青霉烯酶表型确认。MHT阳性质控菌株ATCC BAA-1705，阴性质控菌株ATCC BAA-1706。用亚胺培南/EDTA复合E-test药敏试条协同试验测定最小抑菌浓度(MIC)，单药与复合制剂的MIC比值≥8即可判定产金属酶。

1.3.4 PCR扩增与测序

1.3.4.1 菌株DNA模板的提取 菌株DNA模板的提取采用煮沸法：将菌株置于M-H培养基上，放入HWS智能型恒温恒湿培养箱(37 ℃)中培养16～18 h，取绿豆大小的菌苔置于含有1 ml超纯水的EP管中，混匀，置于沸水中煮沸10 min后，立即放于冰上5 min，然后以离心半径8 cm，12 000 r/min离心10 min，取上清液于新的EP管中，即为PCR模板。

1.3.4.2 引物设计 根据Genbank公布的基因序列，利用引物设计软件Primer 5.0设计引物。引物序列详见表1。

表1 PCR扩增基因引物序列

1.3.4.3 PCR扩增 采用特异引物进行PCR扩增及产物测序，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察结果并拍照。PCR 产物测序由北京六合华大基因有限公司完成。测序结果在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对确定基因型。

2 结果

2.1 菌株资料 清洁中段尿分离的225株多重耐药肠杆菌科细菌中社区感染(门诊或入院48 h内清洁中段尿培养阳性)占25.8%(58株)，院内感染(入院48 h后清洁中段尿培养阳性)占74.2%(167株)，差异有统计学意义(χ2=105.61，P<0.01)。主要分离科室为泌尿外科45株(20.0%)，其次是神经外科28株(12.4%)，门急诊25株(11.1%)，其他科室127株(56.4%)。产ESBLs的细菌203株(90.2%)，分别是大肠埃希菌163株、肺炎克雷伯菌32株、产酸克雷伯菌4株、奇异变形杆菌4株；其他多重耐药肠杆菌科细菌22株(9.8%)，分别为阴沟肠杆菌9株、弗劳地枸橼酸杆菌6株、聚团肠杆菌2株、产气肠杆菌2株、粘质沙雷菌2株、解鸟氨酸克雷伯菌1株。

2.2 药敏试验结果 225株多重耐药肠杆菌科细菌药敏试验结果显示，耐药率>40%的药物有氨曲南(ATM)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶(CAZ)、头孢曲松(CRO)、庆大霉素(CN)、环丙沙星(CIP)和左氧氟沙星(LEV)；耐药率<10%的药物有亚胺培南(IPM)、厄他培南(ETP)、美洛培南(MEM)、阿米卡星(AN)、妥布霉素(TOB)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP，见表2)。药敏试验结果显示所有菌株对3类以上药物耐药，其中有26株细菌对IPM、ETP和MEM中介或耐药(对碳青霉烯类不敏感)。

表2 多重耐药肠杆菌科细菌的药敏试验结果(%)

注：ATM=氨曲南，FEP=头孢吡肟，CAZ=头孢他啶，CRO=头孢曲松，IPM=亚胺培南，ETP=厄他培南，MEM=美洛培南，AN=阿米卡星，TOB=妥布霉素，CN=庆大霉素，CIP=环丙沙星，LEV=左氧氟沙星，TZP=哌拉西林/他唑巴坦，S=敏感，I=中介，R=耐药

2.3 MHT和MBL试验结果 对26株碳青霉烯类不敏感肠杆菌科细菌行MHT有11株阳性，MBL试验有8株阳性(见图1、2)。

注：MHT=改良Hodge试验

图1 MHT结果

Figure 1 The modified Hodge test

注：MBL试验=金属酶筛选试验

图2 MBL试验结果

Figure 2 Metallo-β-lactamases test

2.4 ESBLs基因扩增结果 203株产ESBLs细菌中，122株(60.1%)扩增出TEM型基因，其中大肠埃希菌98株，肺炎克雷伯菌18株，产酸克雷伯菌3株，奇异变形杆菌3株；94株(46.3%)扩增出CTX-M型基因，其中大肠埃希菌79株，肺炎克雷伯菌10株，产酸克雷伯菌2株，奇异变形杆菌3株；32株(15.8%)扩增出SHV型基因，其中大肠埃希菌18株，肺炎克雷伯菌12株，产酸克雷伯菌2株；33株细菌同时扩增出2种基因，6株细菌同时扩增出3种基因(见图3～5)。

图3 TEM型电泳图

2.5 碳青霉烯酶基因扩增结果 MHT阳性和MBL试验阳性菌株经PCR检测结果有3株携带KPC-2基因(弗劳地枸橼酸杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌各1株)；5株携带NDM-1基因(肺炎克雷伯菌2株，弗劳地枸橼酸杆菌2株，产酸克雷伯菌1株)；1株携带IPM-4基因(产酸克雷伯菌，见图6～8)。

图6 KPC电泳图

3 讨论

革兰阴性杆菌是泌尿系感染最多见的细菌，其中以大肠埃希菌较为多见，随着ESBLs、KPC酶、IPM酶和NDM-1等各种耐药酶的出现，临床上细菌的多重耐药现象已比较突出[3-4]。本研究收集的225株多重耐药肠杆菌科细菌中，主要以产ESBLs的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌等菌株为主，可见产ESBLs是引起肠杆菌科细菌多重耐药的主要因素。ESBLs分类属于A类2组2be亚组，是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物的主要耐药机制，其耐药基因主要包括TEM、CTX-M、SHV型。

据国外报道，肠杆菌科细菌ESBLs基因型中TEM型占1.2%～2.2%，CTX-M型占70.9%～76.0%，SHV型占3.6%～26.8%[8-9]。国内TEM型占59.6%～86.3%，CTX-M型占35.5%～93.6%，SHV型占3.4%～27.5%[10]。本研究通过对203株产ESBLs细菌的基因型进行检测，发现TEM型基因占60.1%，CTX-M型基因占46.3%，SHV型基因占15.8%，与国内水平相当，但与胥飚等[11]报道的明显不同。其中有39株细菌同时扩增出2种及以上ESBLs基因，这与文献报道多数产ESBLs菌株同时携带2种以上基因的结果相符[10，12]。由于产ESBLs大肠埃希菌的耐药基因型流行具有复杂性和多样化特点，且呈现区域性流行，不同地区必须加强监测，为预防、控制和治疗提供依据。

肠杆菌科细菌产IPM酶、KPC酶以及NDM-1是导致其对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因，本研究发现有26株细菌对碳青霉烯类药物显示中介或耐药，通过对其进行碳青霉烯酶基因检测，发现有5株携带NDM-1基因、1株携带IPM-4基因，携带菌株分别是肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和弗劳地枸橼酸杆菌，与国内外报道基本一致[13-16]。继2007年我国学者Wei等[17]首次报道在浙江地区发现了产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌后，KPC酶相继在大肠埃希菌、粘质沙雷菌、枸橼酸杆菌等其他肠杆菌中被发现。本研究发现共有3株肠杆菌科细菌携带KPC-2基因，分别是弗劳地枸橼酸杆菌、大肠埃希菌和产酸克雷伯菌。由此可见海南地区泌尿系感染细菌中已有产KPC酶、IPM酶和NDM-1的肠杆菌科细菌在流行传播，各医院应加强对该类菌株的预防和监测工作。

随着NDM-1的出现，细菌的多重耐药问题已成为全球关注的热点，WHO提出“抵御耐药性”，我国也加强了病原学的检测和细菌耐药的监测工作。本研究中院内感染的多重耐药肠杆菌科细菌最多，明显高于社区感染，可见院内感染是导致泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌的主要因素，这与文献报道相符[18]。分离率较高的科室主要为泌尿外科和神经外科，可见泌尿系统疾病和因颅脑疾病长期住院是院内尿路感染的易感因素。在分离的产碳青霉烯酶细菌中全部为院内感染分离菌株，因此加强院内感染预防和控制，不断规范抗菌药物的合理使用，可以有效地降低多重耐药细菌的流行和传播。

总之，本研究显示海南地区泌尿系感染多重耐药肠杆菌科细菌主要以产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，流行的基因型以TEM型多见，其次是CTX-M型和SHV型；已发现少量对碳青霉烯类不敏感菌株，其主要耐药机制为产生NDM-1、KPC-2、IPM-4基因，临床上应引起重视，严格做好预防和控制工作。因本研究仅收集4家医院标本纳入研究，覆盖面不广，存在一定局限性，在后续研究中会扩大标本收集范围，更加全面地了解NDM-1、KPC-2、IPM-4等基因在海南地区泌尿系感染肠杆菌科细菌中的流行现状，以更好地为临床抗感染治疗提供帮助。

[1]钟振锋,萧帼穗,王宏,等.医院感染危险因素分析[J].中华医院感染学杂志,2009,19(3):294.

[2]林菲菲,毛剑锋,金晶,等.尿路感染病原菌分布及大肠埃希菌的耐药性变迁[J].中华医院感染学杂志,2011,21(24):5302-5304.

[3]Gan S,Xiang ST,Lan K,et al.Flora distribution and drug resistance dynamics in urinary tract infection of Guangdong provincal TCM hospital during 2006 to 2008[J].Journal of Modern Urology,2011,16(4):362-364.(in Chinese) 甘澍,向松涛,蓝锴,等.2006-2008年广东省中医医院泌尿系感染病原菌菌群分布及耐药性分析[J].现代泌尿外科杂志,2011,16(4):362-364.

[4]Zhang JH,Zhang LL,Zu YQ.Analysis of the distribution and drug resistance of pathogens responsible for urinary tract infections[J].Journal of Pathogen Biology,2012,7(5):384-386.(in Chinese) 张桔红,张凌玲,祖英秋.泌尿系感染病原菌及其耐药性分析[J].中国病原生物学杂志,2012,7(5):384-386.

[5]Nordmann P,Naas T,Poirel L.Global spread of Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J].Emerg Infect Dis,2011,17(10):1791-1798.

[6]Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI文件M100-S22 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；twenty-second informational supplement[S].Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2012.

[7]卫文.产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南(试行版)[N].中国医药报,2010-10-12(B03).

[8]Díaz MA,Hernández-Bello JR,Rodríguez-Bano J,et al.Diversity of Escherichia coli strains producing extended-spectrum β-lactamases in Spain: second nationwide study[J].J Clin Microbiol,2010,48(8):2840-2845.

[9]Zhanel GG,DeCorby M,Adam H,et al.Prevalence of antimicrobial-resistant pathogens in Canadian hospitals: results of the Canadian Ward Surveillance Study (CANWARD 2008)[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(11):4684-4693.

[10]Pan M,Li W,Chen S,et al.Drug resistance and genotyping of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli among pathogens causing urinary tract infections[J].Chinese Journal of Nosocomiology,2013,23(21):5134-5136,5142.(in Chinese) 潘玫,李稳,陈山,等.泌尿系感染病原菌中产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌耐药特征及基因分型[J].中华医院感染学杂志,2013,23(21):5134-5136,5142.

[11]Xu B,Cao H,Yu XS,et al.Analysis of drug resistance and genotype of extended-spectrum β-lactamase producing Enterobacteriaceae bacteria[J].Journal of Chongqing Medical University,2004,29(6):781-783.(in Chinese) 胥飚,曹何,余显书,等.肠杆菌科产超广谱β-内酰胺酶菌株的耐药性及基因型分析[J].重庆医科大学学报,2004,29(6):781-783.

[12]Xu LS,Liu Y,Wang XL,et al.Study of the genotype of extended-spectrum β-lactamases in Enterobacteriaceae of Xi'an city[J].Journal of Xi'an Jiaotong University：Medical Sciences,2008,29(4):443-445.(in Chinese) 徐灵彬,刘原,王香玲,等.西安地区肠杆菌科细菌的超广谱β-内酰胺酶基因型的研究[J].西安交通大学学报:医学版,2008,29(4):443-445.

[13]Kumarasamy KK,Toleman MA,Walsh TR,et al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India,Pakistan,and the UK: a molecular,biological,and epidemiological study[J].Lancet Infect Dis,2010,10(9):597-602.

[14]Deshpande P,Rodrigues C,Shetty A,et al.New Delhi Metallo-beta lactamase (NDM-1) in Enterobacteriaceae: treatment options with carbapenems compromised[J].J Assoc Physicians India,2010,58:147-149.

[15]Karthikeyan K,Thirunarayan MA,Krishnan P.Coexistence of blaOXA-23 with blaNDM-1 and armA in clinical isolates of Acinetobacter baumannii from India[J].J Antimicrob Chemother,2010,65(10):2253-2254.

[16]Li TJ,Li CX,Chen SP,et al.The isolation and identification for 9 strains of Enterobacteriaceae with blaNDM-1 in Hainan[J].Chinese Journal of Laboratory Medicine,2014,37(1):36-40.(in Chinese) 李天娇,李成学,陈淑萍,等.海南9株携带blaNDM-1基因肠杆菌科细菌的分离和确认[J].中华检验医学杂志,2014,37(1):36-40.

[17]Wei ZQ,Du XX,Yu YS,et al.Plasmid-mediated KPC-2 in a Klebsiella pneumoniae isolate from China[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(2):763-765.

[18]Liu Y,Xu LS,Geng Y,et al.Extended spectrum β-lactamases among enterobacteriaceae in Xi'an city:an epidemiological survey and analysis of risk factors for infections by ESBLs-producing strains[J].Chinese Journal of Nosocomiology,2007,17(8):910-913.(in Chinese) 刘原,徐灵彬,耿燕,等.肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶的流行病学特征研究[J].中华医院感染学杂志,2007,17(8):910-913.

(本文编辑：崔丽红)

Urinary System Infection of Multidrug-resistant Enterobacteriaceae:A Molecular Epidemiology Analysis

YUNChang-ying，WUDuo-rong，HUANGHui，etal.

HaikouCenterforDiseaseControlandPrevention，Haikou571100,China

Objective To investigate the epidemic characteristics of urinary system infection of multidrug-resistant enterobacteriaceae and its resistance mechanisms in Hainan District.Methods A total of 225 multidrug-resistant enterobacteriaceae isolated from midstream urine specimens in outpatients and inpatients from January 2012 to August 2013 in Hainan District.An identification of bacteria and drug sensitive test were carried out with VITEK 2 compact microbial ananlyzers,extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) by confirmatory test,carbapenemase phenotype confirmation performed on carbapenems insensitive strains by modified Hodge test (MHT) and metallo-β-lactamases (MBL) test,ESBLs,KPC enzyme,IPM enzyme,NDM-1 genotypic testing performed on positive strains by PCR amplification and the amplified products sequenced.Results A total of 203 from 225 strains of multidrug-resistant enterobacteriaceae produced ESBLs (90.2%),including 163 strains of escherichia coli,32 strains of klebsiella pneumoniae,4 strains of klebsiella oxytoca,4 strains of proteus mirabilis,22 strains of others (9.8%).By drug sensitive test,there were 26 strains of carbapenems insensitive bacteria,11 strains were positive by MHT,8 were positive by MBL test.By genetic testing of PCR amplififcation,3 strains carried KPC-2 gene,5 carried NDM-1 gene,1 carried IPM-4 gene.In ESBLs genotypes,TEM accounted for 60.1% (122/203),CTX-M for 46.3% (94/203),SHV for 15.8% (32/203).39 strains amplified 2 or more genotypes at the same time.Conclusion In Hainan District,multidrug-resistant enterobacteriaceae in urinary tracts are mainly escherichia coli and klebsiella pneumoniae producing ESBLs,their epidemic genotypes are mainly TEM,followed by CTX-M and SHV.We have found a small amount of carbapenem-insensitive strains,their main resistance mechanisms are producing NDM-1,KPC-2 and IPM-4 genes,which should be paid attention to.

Urologic diseases；Enterobacteriaceae infections；Molecular epidemiology

海口市重点科技计划项目(2012-070)

571100海南省海口市疾病预防控制中心(云长缨)；海口市人民医院(吴多荣，黄会，佘姝敏)；广州医科大学附属第一医院(黄增光)

吴多荣，570208海南省海口市人民医院；E-mail：wuduorong@163.com

R 69

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.11.023

2014-06-10；

2014-10-25)