不同截留分子量超滤中空纤维柱浓缩牛病毒性腹泻病毒效果比较

苍 枫 陈光达 羡东堡 金宇保灵生物药品有限公司 010030

牛病毒性腹泻(BVD)又称黏膜病(MD)，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的以高热、白细胞减少、沉郁、不食、下痢、大量流涎、减奶以至停奶、反刍停止、结膜炎和口腔黏膜充血出现溃疡斑为特征的一种传染病，怀孕牛可能发生流产或产出畸形胎儿，新生犊牛经常发生致死性腹泻[1]。中空纤维膜超滤技术广泛应用于动物疫苗浓缩工艺中，选择适宜孔径的超滤膜能够有效去除病毒收获液中的杂蛋白成分，提高单位体积内的病毒含量。本试验分别采用截留分子量为300NMWC 和500NMWC的中空纤维超滤膜系统对BVDV 病毒进行浓缩，并对两种不同截留分子量中空纤维膜浓缩效果进行了比较，现报道如下。

1 材料与方法

（1）材料。MDBK 细胞由金宇保灵生物药品有限公司国家兽用疫苗工程实验室提供，BVDV NMG 株由中国兽药监察所提供。中空纤维超滤系统购自GE公司，型号为VERSAFLUX。中空纤维超滤柱购自GE公司，具体型号为UFP-E-300-4X2MA 及UFP-E-500-4X2MA。其他试剂均为国产分析纯。

（2）方法。将BVDV NMG 株按1%比例接种至长成致密单层的MDBK 细胞中，置37 培养1 小时；弃去培养液，用0.01molLPBS 冲洗去除牛血清，加入维持液（含2%胎牛血清的DMEM）。待细胞病变达到90%以上时，反复冻融3 次，收获病毒液。将收获的BVDV 病毒液合并后分为2 份，每份4L。分别用300NMWC 中空纤维超滤柱和500NMWC 中空纤维超滤柱进行浓缩，最终浓缩倍数为10 倍。采用凯氏定氮法测定BVDV 原液、浓缩液和透过液中的蛋白含量，并计算蛋白去除率。使用MDBK 细胞测定BVDV原液、浓缩液和透过液中病毒TCID50，并按照Reed-Muench 法计算。

2 结果与分析

（1）透过液中病毒TCID50 检测结果。300NMWC超滤膜和500NMWC 超滤膜浓缩过程中，透过端料液接种MDBK 细胞后均未产生细胞病变。300NMWC中空纤维系统超滤浓缩后，平均蛋白去除率为65.9%,平均病毒滴度为5.17；500NMWC 中空纤维系统超滤浓缩后，平均蛋白去除率为72.8%,平均病毒滴度为5.42。结果表明，500NMWC 中空纤维系统具有更高的蛋白去除率和病毒回收率。具体结果见表1 和表2。

表1 300K BVDV 原液、浓缩液蛋白含量及病毒TCID50 测定结果

表2 500K BVDV 原液、浓缩液蛋白含量及病毒TCID50 测定结果

3 讨论

超滤浓缩工艺是较为常见的病毒或者抗原浓缩技术手段，该工艺已用于狂犬病毒疫苗、流感疫苗等疫苗的纯化和浓缩，并取得了良好的蛋白去除效果和抗原浓缩效果[2,3]。由于病毒增殖后收获液中存在大量的杂蛋白成分，制成疫苗后这些成分会导致较为严重的副反应[4]。浓缩后的病毒液或者抗原液有效成分含量有所提高，降低杂蛋白含量，从而提高疫苗的免疫效果。本试验比较了300NMWC 和500NMWC 中空纤维超滤膜在BVDV 浓缩过程中的区别。结果表明，500NMWC 中空纤维系统具有更高的蛋白去除率和病毒回收率。另外，500NMWC 中空纤维系统浓缩时间更短，剪切力更小，这也是500NMWC 中空纤维膜回收率较高的原因。综上所述，本试验初步解决了BVDV 中空纤维超滤浓缩工艺柱选型问题，为未来BVDV 纯化工作奠定了基础。

[1]Bachofen,C.,H.Stalder,H.R.Vogt,et al.Bovine viral diarrhea(BVD)from biology to control[J].Berl Munch Tierarztl Wochenschr ,2003,126(11-12):452-461.

[2]张磊，黄林，周兰斌，等.人用Vero 细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立［J].预防医学情报杂志,2003,19(3):198-199.

[3]张钰,罗德炎,刘俊生,等.人用禽流感裂解疫苗生产工艺的研究[J].解放军医学杂志,2006.,31(12):1209-1210.

[4]任培森；吕文静；丁壮.高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗纯化浓缩效果的研究[J].中国预防兽医学报,2013,35(2):103-106.