rhKD/APPvar对实验性急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响

王虹蛟，孟威宏，王 强*，王心童，颜炜群，任立群



·论著·

rhKD/APPvar对实验性急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响

王虹蛟1，孟威宏2，王 强1*，王心童3，颜炜群4，任立群4

目的 探讨重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(Reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant，rhKD/APPvar)对实验性急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响。方法利用实验鼠的四氯化碳(CCl4)慢性肝损伤模型，采用免疫组化方法，检测各组增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性细胞数。结果正常对照组的PCNA阳性细胞数为(2±2)个/视野，模型组的PCNA阳性细胞数为(6±3)个/视野，rhKD/APPvar小、中、大剂量组的PCNA阳性细胞个数分别为(29±110)个/视野、(38±10)个/视野、(55±12)个/视野，抑肽酶组的PCNA阳性细胞个数为(24±9)个/视野，rhKD/APP组的PCNA阳性细胞个数为(19±5)个/视野。与模型组相比，rhKD/APPvar各剂量组PCNA阳性细胞数目均显著增加(P<0.05)，并且存在剂量依赖关系。rhKD/APPvar各剂量组阳性细胞数多于抑肽酶组。结论rhKD/APPvar能够促进急性肝损伤小鼠肝细胞增殖，其作用随着剂量的增加而增强。

rhKD/APPvar；四氯化碳；急性肝损伤；小鼠；免疫组织化学

0 引言

肝损伤防治研究是国内外研究的热点[1-6]。本文首先利用昆明小鼠建立四氯化碳(CCl4)肝损伤模型，然后用重组人淀粉样蛋白前体中的Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体(Reorganization human KD/APP variant，rhKD/APPvar)进行治疗，通过免疫组织化学染色法观察各组小鼠肝细胞的增殖能力，探讨rhKD/APPvar对急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 70只健康昆明种小鼠，6～8周龄，雌雄各半，体重20～23 g。购自长春高新医学动物研究中心(动物许可证：医动字第1055113)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠急性CCl4肝损伤模型的建立 将CCl4溶解于市售精制花生油中，配制浓度为0.1%(V/V)的CCl4油溶液。正常对照组按20 mL/kg剂量腹腔注射花生油，其他各组小鼠按20 mL/kg剂量腹腔注射0.1% CCl4油溶液。禁食不禁水。

1.2.2 动物分组及给药 昆明种小鼠随机分为7组：正常对照组(空白组)、CCl4中毒模型组(模型组)、rhKD/APPvar小、中、大剂量组及抑肽酶组、rhKD/APP组，每组10只。空白组和模型组腹腔注射等量生理盐水；rhKD/APPvar小、中、大剂量组每天分别腹腔注射2、4、8万KIU/kg的rhKD/APPvar,给药7 d；抑肽酶组每天腹腔注射4万KIU/kg抑肽酶，给药7 d；rhKD/APP组每天腹腔注射4万KIU/kg的rhKD/APP，给药7 d。末次给药1 h后，腹主动脉取血，检测血清中ALT、AST水平。

1.2.3 免疫组织化学染色 末次给药1 h后，处死小鼠，取肝大叶相同部位的肝组织,在10%福尔马林中固定，按常规方法制作组织切片。①脱蜡与修复：石蜡切片进行常规脱蜡(二甲苯洗2次，每次30 min；无水乙醇洗2次，每次10 min；95%乙醇洗2次，每次5 min；80%乙醇洗1次，5 min)，蒸馏水洗2次之后，将切片置于枸橼酸盐修复液中，98 ℃加热修复；②待切片冷却至40 ℃以下之后，滴加3% H2O2，以灭活内源性过氧化物酶活性，室温孵育15 min之后，用PBS冲洗3次，每次5 min；③利用兔血清封闭，室温孵育30 min，甩去多余血清；④滴加兔抗人PCNA抗体(1∶100稀释)，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；⑤滴加二抗，室温孵育20 min，PBS冲洗3次，每次5 min；⑥滴加三抗，室温孵育20 min，PBS冲洗3次，每次5 min；⑦滴加DAB显色1 min，用自来水中止发色；⑧苏木素复染5 min，弱氨水返蓝10 s，自来水冲洗；⑨脱水、透明及封片：80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ及100%乙醇Ⅱ脱水各5 min；二甲苯透明2次，每次5 min；树胶封片。

1.3 判定标准 在200倍显微镜下，每张切片选取5个不同视野，计数每个视野中的增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性细胞数。

2 结果

2.1 PCNA阳性细胞数结果 空白组的PCNA阳性细胞数为(2±2)个/视野，模型组PCNA阳性细胞数为(6±3)个/视野；rhKD/APPvar小、中、大剂量组的PCNA阳性细胞个数分别为(29±11)个/视野、(38±10)个/视野、(55±12)个/视野；抑肽酶组PCNA阳性细胞个数为(24±9)个/视野；rhKD/APP组PCNA阳性细胞个数为(19±5)个/视野。rhKD/APPvar各剂量组的PCNA阳性细胞数目均显著高于模型组(P<0.05)；rhKD/APPvar剂量越大，PCNA阳性细胞数目越多。提示rhKD/APPvar能够促进肝细胞增殖，并存在剂量依赖关系。rhKD/APPvar各剂量组PCNA阳性细胞数也多于抑肽酶组。

2.2 形态学结果 PCNA免疫组织化学染色结果显示，rhKD/APPvar各剂量组肝组织中的PCNA阳性细胞增殖均较为活跃，其以rhKD/APPvar大剂量组的PCNA阳性细胞增殖最为活跃(图1)。

图1 肝细胞PCNA阳性细胞增殖形态(×200)

3 讨论

目前国内外多采用CCl4建立肝损伤模型[7-10]。CCl4主要经呼吸道和消化道进入体内，导致肝脏损伤，这可能与CCl4自身和其自由基代谢产物有关。CCl4进入体内后，生成代谢产物三氯甲基自由基(CCl3·)和氯自由基(Cl·)。CCl3·能够与细胞膜的不饱和脂肪酸发生反应，生成脂肪酸，引起膜的脂质过氧化，导致膜结构和功能受到破坏，最终导致肝细胞发生坏死[11]。CCl3·还抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵的活性，导致Ca2+离子内流增加，最终引起细胞坏死。在缺氧条件下，CCl3·能引起多不饱和脂肪酸过氧化而导致肝细胞破裂。Samar等[12]发现CCl4引起的肝损害是通过自由基所诱导的脂质过氧化反应产生的，自由基和环氧合酶介导的花生四烯酸产物的氧化与实验性的肝毒性密切相关。

增殖细胞核抗原(PCNA)只表达于正常的增殖细胞以及肿瘤细胞中，在细胞增殖的启动过程中具有重要作用，因此，PCNA是反映细胞增殖状态的重要指标。本文通过检测实验鼠肝组织中PCNA阳性细胞的数量，来评价急性肝损伤小鼠肝细胞的增殖能力。

淀粉样蛋白前体中的Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域(KD/APP)是人Kunitz型蛋白酶抑制剂，具有强烈抑制丝氨酸蛋白酶的活性。本研究利用肝损伤的动物模型，探讨rhKD/APPvar对急性肝损伤小鼠肝细胞增殖能力的影响。利用免疫组织化学技术，检测各实验组肝细胞的PCNA表达水平，从而评价各组肝细胞的增殖情况。结果显示，rhKD/APPvar各剂量组的PCNA阳性细胞数均多于模型组，随着rhKD/APPvar剂量的增加，PCNA阳性细胞数目也增加。说明rhKD/APPvar能够促进急性肝损伤肝细胞增殖，并存在剂量依赖关系。rhKD/APPvar各剂量组PCNA阳性细胞数多于抑肽酶组和rhKD/APP组。

实验结果表明，rhKD/APPvar可以促进PCNA阳性细胞的增殖，减轻急性肝损伤的程度，对小鼠急性CCl4肝损伤模型具有较好的保护性作用，为急性肝损伤的保护及治疗提供了实验依据。

[1] Posadas SJ,Caz V,Caballero I,et al.Effects of mannoprotein E1 in liquid diet on inflammatory response and TLR5 expression in the gut of rats infected by Salmonella typhimurium[J].BMC Gastroenterol,2010,10(1):58.

[2] Greif F,Ben-Ari Z,Taya R,et al.Dual effect of erythropoietin on liver protection and regeneration after subtotal hepatectomy in rats[J].Liver Transpl,2010,16(5):631-638.

[3] Ellett JD,Atkinson C,Evans ZP,et al.Murine Kupffer cells are protective in total hepatic ischemia/reperfusion injury with bowel congestion through IL-10[J].J Immunol,2010,184(10):5849-5858.

[4] 王强,王心童,王虹蛟,等.抑肽酶对实验性慢性肝损伤超微结构改变影响的研究[J].实用药物与临床,2014,17(6):667-670.

[5] 王虹蛟,王心童,王强,等.抑肽酶对实验性慢性肝损伤大鼠肝细胞增殖能力的影响[J].吉林大学学报:医学版,2011,37(1):18-20.

[6] 孟威宏,王虹蛟,王强,等.rhKD/APPvar对实验性慢性肝损伤肝组织纤维化影响的研究[J].中国实验诊断学,2013,17(2):255-258.

[7] Wassers S,Tan CE.Expermental models of hepatic fibrosis in the rat[J].Ann Acad Med Singapore,1999,28(1):109-111.

[8] Soni MG,Mehendale HM.Role of tissue repair in toxicologic interactions among hepatotoxic organics[J].Environ Health Perspect,1998,106(Suppl):6307-6317.

[9] McGregor D,Lang M.Carbon tetrachloride:genetic effects and other modes of action[J].Mutat Res,1996,366(3):181-195.

[10]万君,叶菊风,叶俊,等.穿心莲内酯对小鼠急性四氯化碳肝损伤的保护作用[J].实用医学杂志,2014,30(14):2204-2207.

[11]Berger ML,Bhatt H,Combes B,et al.CCl4-induced toxicity in isolated heptocytes[J].Hepatology,1986,6(1):36-45.

[12]Czapinska H,Otlewski J,Krzywda S.High resolution structure of bovine pancreatic trypsin inhibitor with altered binding loop sequence[J].J MOL Biol,2000,32(2):1237-1249.

Effect of rhKD/APPvar on hepatocyte proliferation ability in mice with acute liver injury

WANG Hong-jiao1,MENG Wei-hong2,WANG Qiang1*,WANG Xin-tong3,YAN Wei-qun4,REN Li-qun4

(1.The 461 Hospital of PLA,Changchun 130021,China; 2.The General Hospital of Shenyang Military District,Shenyang 110016,China; 3.China-Japan Union Hospital,Jilin University,Jilin 130033,China; 4.The Institute of Frontier Medical Science,Jilin University,Jilin 130021,China)

Objective To study the effect of reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant (rhKD/APPvar) on hepatocyte proliferation ability in mice with experimental acute liver injury and provide theoretical basis for study on protective effect of rhKD/APPvar on acute liver injury.MethodsThe acute hepatic injury model of rats were induced by carbon tetrachloride (CCl4).Immunohistochemical method was used to observe the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-positive cell number in various groups.ResultsThe positive cell number in control group was (2±2)/vision; (6±3)/vision in model group; (29±11)/vision,(38±10)/vision and (55±12)/vision in low,middle,and high dose rhKD/APPvar groups; (24±9)/vision in aprotinin group,(19±5) /vision in rhKD/APP group.The positive cell numbers in rhKD/APPvar group markely increased compared with model group(P<0.05),the positive cell number increased with the increase of rhKD/APPvar.The positive cell numbers in rhKD/APPvar groups were more than those in aprotinin group.ConclusionThe rhKD/APPvar could promote the proliferation of acute injured liver cells and the effect could be enhanced by titrating of rhKD/APPvar.

rhKD/APPvar; Carbon tetrachloride; Acute hepatic injury; Mice; Immunohistochemistry

2014-12-25

1.长春解放军第461医院，长春 130021；2.沈阳军区总医院，沈阳 110016；3.吉林大学中日联谊医院，吉林 130033；4.吉林大学再生医学科学研究所，吉林 130021

国家自然基金课题(30300153)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505001

*通信作者