丽江市古城区首次证实一起鼠间鼠疫疫情

谭红丽,郭 英,杨文艳,陈福美,张福新,张正飞,王 鹏

丽江市古城区首次证实一起鼠间鼠疫疫情

谭红丽1,3,郭 英1,杨文艳2,陈福美2,张福新2,张正飞2,王 鹏1

目的 对丽江市古城区的一起鼠间鼠疫进行判定。方法 对1份干燥自毙大绒鼠标本进行鼠疫反相间接血凝抑制试验(RIHA)、聚合酶链式反应(PCR)及实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测。结果 该标本经免疫学检测、PCR及RT-PCR检测均为阳性。结论 确认丽江市古城区鼠间鼠疫疫情。

鼠疫;实时荧光定量PCR;自毙鼠;丽江市古城区

2005年10-11月间，云南省丽江市玉龙县黄山镇南溪村委会鹿子村发生一起聚集性5人发病，其中2人死亡的肺鼠疫事件，次年11月从鹿子村拣获的自毙鼠中分离到了鼠疫菌，从而证实了玉龙县鼠疫自然疫源地的存在[1]。

2014年5月7日丽江市玉龙县黄山镇再次发生鼠间鼠疫。为进一步明确此次疫情的疫区范围，进行了大规模的自毙鼠搜索。2014年5月15日，在丽江市七河镇后山村委会木梳自然村拣获了1只自毙大绒鼠，对该标本进行了F1抗原免疫学检测、PCR和RTPCR检测，操作按常规，现将结果报告如下。

1 结 果

1.1 反相血凝抑制试验结果 对该标本胶体经初筛结果呈强阳性见图1-A，同时进行了反相血凝抑制试验(RIHA)，结果显示：在首孔为1∶80稀释度时，血凝列阳性达到6孔，同时抑制列只有前两孔阳性，4孔被抑制，而单宁酸列全为阴性，综合判断其鼠疫F1抗原特异效价为1∶2 560，见图1-B。

1.2PCR结果 根据鼠疫诊断卫生行业标准(WS279-2008)，以鼠疫菌的fra(249bp)与pla(456bp)二对基因的片段作为PCR扩增的目标基因，结果为阳性见图2。

图1 鼠疫F1抗原免疫学检测结果Fig.1 Plague F1 antigen immunoassay results

1.3 RT-PCR检测结果 该标本caf1、pla及YPO0392三对基因皆出现阳性峰图，其中pla出现峰图最早，caf1与YPO0392较迟，且Ct值与模板量成正相关，即2 μL标本DNA的Ct值较1 μL标本DNA的Ct值要小。见图3。

图2 PCR扩增的目标基因结果Fig.2 Results of target gene PCR amplification

图3 采用鼠疫三对特异基因对标本进行RT-PCR检测结果图Fig.3 The PCR RT-test results of the specimens were carried out using three pairs of specific genes of plague

2 讨 论

2.1 丽江古城区首次证实鼠间鼠疫疫情 丽江市古城区位于云南省西北部横断山脉向云贵高原过渡地带，下辖金山、七河、金江、金安、大东5个乡和大研、西安、束河、祥和4个街道，共53个村(居)委会，总人口14.2万人，有纳西、汉、白、藏、彝、普米等10余个民族。古城区为滇西北通向川、藏连接内地的枢纽，丽江机场位于古城区的七河乡，为口岸机场，目前已开通多条国内航线。

此次证实的鼠疫疫点位于七河镇的木梳村，离2005年人间鼠疫疫点鹿子村只有5 km，从地理上讲是同一片区域，只是人为行政区划为两个县。丽江机场虽在七河乡，但木梳离机场的直线距离达12 km，作为鼠疫宿主的齐氏姬鼠和大绒鼠主要栖居于山区的原生林、次生林及农耕区，对于地处坝区现代城镇，则不是野鼠的栖居之所，因此山区农耕区的农民接触鼠疫的几率大于坝区居民，因此从事农业生产的农民是我们健康教育的重点人群。

2.2 采用RT-PCR替代普通PCR 2008年9月新修订了鼠疫诊断卫生行业标准(WS279-2008)[2]，对没有分离到鼠疫菌的疑似标本，除免疫学检测阳性外，还要求基因检测阳性，方可作出诊断。在现场工作时，快速准确的诊断尤为重要。现行诊断标准中所提供的基因检测方法是普通PCR方法，随着技术的进步，RT-PCR越来越成为疾病诊断的主流方法，而在鼠疫诊断上也早有报道[3-4]。本实验采用鼠疫caf1及pla两个特异基因的引物与探针成功扩增出片段，并同时采用了鼠疫染色体上的一个标识基因[5]进行检测，结果与普通pcr相符，其诊断时间比传统的PCR要节约2 h。

本次研究中pla出现峰图较早，而caf1与 YPO0392较迟，这正精确反映了鼠疫基因组的情况，caf1基因位于鼠疫菌的PMT1质粒上，而该质粒在鼠疫菌中是单拷贝的；YPO0392位于染色体上，鼠疫菌中也只有一条染色体；pla基因则位于鼠疫菌pPCP1质粒上，该质粒在鼠疫菌中是多拷贝的。这就是说，对于一定的菌量，pla基因的拷贝数要大大多于caf1与 YPO0392基因的拷贝数的，即在RT-PCR实验时，理论上讲，前者的Ct值要比后两者的小，该实验结果也很好地与此理论相符。

总之，本次实验中RT-PCR的成功应用为今后鼠疫现场诊断又提供了一个成功案例，并可以预测在今后鼠疫的基因诊断中，RT-PCR替代普通PCR将成为趋势。

(对参加丽江鼠疫疫情处理的古城区CDC、玉龙县CDC、丽江市CDC及云南省地方病防治所的同志们表示诚挚感谢！)

[1]Guo Y, Zhang LY, Xia LX, et al. Biochemical characters ofYersiniapestisisolated from Yulong County of Yunnan Province in China[J]. Endem Dis Bull, 2008, 23(3): 12-14. (in Chinese) 郭英,张丽云,夏连续,等. 云南省玉龙县鼠疫菌的生化特性[J]. 地方病通报, 2008,23(3):12-14.

[2]Diagnostic criteria of Plague (WS279-2008) / health industry standards of the people’s Republic of China (ISBN: 14117208)[S]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2008.(in Chinese) 鼠疫诊断标准(WS279-2008) /中华人民共和国卫生行业标准(ISBN：14117208)[S].北京：人民卫生出版社，2008.

[3]Zhang ZK, Hai R, Cai H, et al. Detection ofYersiniapestismultiplex polymerase chain teaction [J]. Chin J Infect Ctrl, 2007, 26 (5): 475-477. (in Chinese) 张志凯，海荣，蔡虹，等. 多重PCR检测方法在鼠疫监测中的应用[J].中国地方病学杂志,2007,26(5):475-477.

[4]Li W, Hai R, Yu DZ, et al. Detection ofYersiniapestisfrom mice tissues and soil by real-time fluorescence polymerase chain teaction[J]. Chin J Vector Biol Ctrl, 2005, 16(4): 301-304. (in Chinese) 李伟，海荣，俞东征，等. 应用荧光定量PCR检测环境样品中鼠疫耶尔森菌[J].中国媒介生物学及控制杂志,2005,16(4):301-304.

[5]Han YP, Zhou DS, Song YJ, et al. Detection of DNA tag sequences for rapid identification ofYersiniapestis[J]. Med J Chin PLA, 2004, 29(4): 307-309. (in Chinese) 韩延平，周冬生，宋亚军，等. 鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究[J].解放军医学杂志,2004,29(4)：307-309.

Determination of a rat plague epidemic in ancient city administrative region of Lijiang, China

TAN Hong-li1,3,GUO Ying1,ZHANG Fu-xin2,YANG Wen-yang2,CHEN Fu-mei2,ZHANG Zheng-fei2, WANG Peng1

(1.YunnanProvincialKeyLaboratoryforZoonosisControlandPrevention,YunnanInstituteforEndemicDiseaseControlandPrevention,Dali671000,China;2.LijiangCenterforDiseaseControlandPrevention,Lijiang674100,China;3.SchoolofPublicHealth,DaliUniversity,Dali67100,China)

To determine a rat plague epidemic in ancient city administrative region of Lijiang, China, one of drying self-deadEothenomysmiletuswere detected with methods of reverse indirect hemoagglutination inhibition test (RIHA), Polymerase Chain Reaction (PCR) and real-time PCR (RT-PCR). Results showed that the immunological detection, PCR and RT-PCR detection to this sample were positive. It was confirmed that a rat plague epidemic occurred in ancient city administrative region of Lijiang.

plague; real time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR); self-dead rodent; ancient city administrative region of Lijiang

Wang Peng, Email: wp03801@126.Com

王鹏，Email：wp030801@126.com

1.云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室，大理 671000； 2.丽江市疾病预防控制中心 云南 丽江674100; 3.大理大学公共卫生学院,大理 671000

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.11.021

R516.8

A

1002-2694(2015)11-1086-03

2015-01-16；

2015-03-17