miR-15b在内皮细胞的功能及其与血管相关性疾病的关系

陈良榉，杨明，陈艳，孙华钦，许文明,2



miR-15b在内皮细胞的功能及其与血管相关性疾病的关系

陈良榉1，杨明1，陈艳1，孙华钦1，许文明1,2

1. 四川大学华西第二医院，四川大学-香港中文大学生殖医学联合实验室，教育部出生缺陷与相关妇儿疾病重点实验室，成都610041；2. 四川大学，四川大学华西第二医院妇产科，成都 610041

微小RNA(MicroRNA, miRNA)是长度为22个核苷酸的小片段非编码RNA，作为RNA干扰的参与者之一，其通过在转录后水平调节各种基因的表达，进而对细胞的生命活动产生广泛影响。miR-15b是miR-15/16家族一员，是一类在机体各系统、特别是血管内皮系统广泛表达的微小RNA，主要影响细胞的增殖、凋亡、侵袭、成管等行为。文章主要对miR-15b及相关家族成员在各类细胞、特别是血管内皮细胞的生物学行为、作用机制及miR-15b在心血管相关疾病的发生、发展及预后等过程中的作用进行了详细阐述。同时，文章对miR-15b相关家族成员在以胎盘内皮发育异常为病理基础的妊娠期高血压疾病如子痫前期的发病机制中的作用进行了探讨。

miR-15b；增殖；侵袭；肿瘤；子痫前期

MicroRNA(miRNA)属小片段调节性RNA[1]，片段长度在22个核苷酸左右，尽管不直接编码蛋白质，但作为RNA干扰(RNAi)活动的媒介物广泛地存在于细胞中，在转录后水平发挥调节作用。miRNA的产生和成熟以及功能执行的过程如下：在细胞核内miRNA基因通过转录、剪接等过程形成长片段双链的具有发卡结构的前体miRNA(pre-miRNA)；pre-miRNA进入细胞质后，在双链RNA核酸内切酶Dicer核酸酶的剪切下形成双链miRNA(miRNA duplexes)；成熟的miRNA从双链miRNA释放出来后结合到Ago蛋白上，形成核心效应复合体miRNA/Ago核糖核酸蛋白，即miRNP；作为miRNP组成部分的miRNA以其自身核酸序列为基础扮演一种特异性决定者的角色，一般通过其5¢端的种子序列(Seed sequence)与靶mRNA 3¢端非翻译区(3¢-UTR)序列互补配对[2]，也可能通过识别靶mRNA的开放阅读框(Open reading frame)[3]，将与它们结合的Ago蛋白定位到此miRNA的靶mRNA上；定位到靶mRNA上的miRNP抑制该mRNA翻译或者降低其稳定性，进而起到沉默相应基因表达的作用。

基于miRNA靶向调节mRNA的作用机制，miRNA的5¢末端区域对其功能是尤为重要的决定因素[4]，5¢末端序列相似的一组miRNA常常具有许多相同的靶mRNA。因此，根据成熟miRNA的5¢末端序列相似程度，可以将它们进行功能上的分类。miRNA-15b所在miRNA家族成员的相似之处表现为从5¢末端第2个核苷酸开始的一段AGCAGC序列[5]，人类共享这一序列特点的miRNA主要有hsa-miR-15a、hsa-miR-15b、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-497、hsa-miR-503、hsa-miR-424、has-miR-646；由于hsa- miR-103、hsa-miR-107第1个核苷酸开始也有一段AGCAGC序列，并且其功能与miR-15超家族有相重叠的地方，进而有时将两者并称为miR-15/107组群进行研究。Finnerty等[6]于2010年发表了关于miR-105/107组群的综述，详细阐明了它们在进化生物学和细胞功能上的共同特点以及在人类疾病中的角色。从进化生物学的角度来看，尽管miR-15/107组群在物种之间的表达谱随物种“亲缘关系”的远近有着程度不等的差异，同时各个成员之间在染色体上的位置也不尽相同，但这些miRNA在序列和功能方面相对保守，现有的证据尚不能分析出到底是由同一个祖先基因分化出了miR-15超家族与miR-107超家族，还是两者正在汇聚成一个基因超家族；从发育生物学的角度来看，miR-15/107组群在人类的各种组织(心、骨骼肌、脑、肺、肝、肾、脾、胎盘)广泛表达[7,8]，未见明显的组织特异性(空间特异性)，但在红细胞生成[9~11]过程和脑发育[12,13]过程中，对此miRNA组群表达谱的筛查却发现有发育阶段特异性(时间特异性)；miR-15/107组群对靶mRNA的识别和处理遵循miRNA作用的普遍原理，值得注意的是，其部分成员的靶位涵盖了Dicer[14]和Ago[15]，从而构成了对整个miRNA生成和作用系统的负反馈抑制。miR-15/107组群通过对其靶mRNA的干扰，影响细胞的分裂、能量代谢、血管生成等功能，进而参与到肿瘤、退行性变等多种人类疾病中。

1 miR-15b对细胞行为学的影响及其机制

miR-15b最先由Lagos-Quintana等[16]在小鼠组织中检测出来，随后经Michael等[17]证实也存在于人类组织。hsa-miR-15b基因位于染色体3q25.33，与hsa-miR-16-2基因同簇[18]。miR-15b对细胞行为的影响建立在它所调控的靶蛋白及其信号通路的功能基础之上，通过以多种信号蛋白的mRNA为靶位在转录后水平抑制其调控基因的表达，再经过这些蛋白所在信号通路传递这种变化的信息，从而对细胞的增殖、凋亡、侵袭、成管等行为产生广泛的影响。

1.1 miR-15b以cyclin E和cyclin D1 mRNA为靶位参与调控细胞增殖活动

细胞分裂要求细胞从静息状态越过限制点R进入细胞分裂周期[19]，此过程需要整合、启动并推进多种信号转导通路，cyclin E(包括cyclin E1和cyclin E2)在G1期结合到Cdk2(cyclin dependent kinase 2)形成复合物，它不仅推动细胞进入S期，同时在启动DNA复制、维持基因组稳定性、控制中心体周期等方面也扮演着重要角色。cyclin E表达于细胞周期的G1晚期至S期末，在转录水平上主要受E2F转录因子家族的调节，其蛋白则通过蛋白酶体途径降解。

对胶质瘤的研究发现，miR-15b可以通过以cyclin为靶位调节细胞周期进程[20]；Bueno等[21]的研究工作进一步表明，E2F通过与相应启动子的结合在转录水平上激活miR-15a、miR-15b和miR-16的表达，而miR-15和miR-16又以cyclin E的mRNA为靶位在转录后水平上降低cyclin E表达，由于E2F同时也是促进cyclin E表达的转录调节因子，故在miR-15b及其家族成员参与下形成了一个对E2F至cyclin E的前馈调节环，这些miRNA通过此机制起到抑制细胞增殖活动的作用。近期，Sun等[22]研究发现，miR-15b还能通过以cyclin D1为靶位调节胶质瘤细胞的增殖和凋亡活动，而cyclin D1可与Cdk4/6结合，同cyclin E一样，发挥对细胞周期的正向调节作用。

1.2 miR-15b以Bcl-2 mRNA为靶位参与调控细胞凋亡过程

细胞凋亡是一个主动过程[23]，主要涉及蛋白水解酶caspase家族的激活，由线粒体释放的细胞色素c等膜间隙蛋白发挥触发并强化caspase激活通路的作用，因而线粒体膜通透性的变化在细胞凋亡中占有举足轻重的地位。Bcl-2家族包括20多个成员，对线粒体膜通透性起着直接或间接的调节作用，此家族成员根据其功能划分为促进凋亡和抑制凋亡两大类，具有BH4结构域的Bcl-2属于抑制凋亡类成员。

Guo等[24]对大鼠肝星状细胞的研究、Chung等[25]对肝细胞癌的研究、An等[26]对急性肝衰竭肝细胞的研究以及Xia等[27]和Sun等[28]对胃癌细胞的研究均发现，在细胞中miR-15b表达水平与Bcl-2表达水平呈现相反的关系，即过表达miR-15b时Bcl-2水平降低，降低miR-15b水平则Bcl-2表达升高。通过荧光素酶报告基因检测证实了miR-15b以Bcl-2 mRNA的3¢-UTR为靶位在转录后水平上抑制Bcl-2的表达，同时发现细胞凋亡随miR-15b表达水平升高而增强，表明miR-15b通过下调Bcl-2而促进细胞凋亡。

1.3 miR-15b以内皮生长因子受体NRP-2和VEGFR-2 mRNA为靶位参与调控细胞侵袭和成管能力

细胞的粘附、迁移、侵袭及成管行为，尽管涉及的信号通路繁复，但是有一个共同的节点——血管内皮生长因子VEGF及其受体家族[29~31]。目前，VEGF家族由5个结构相关的因子所构成——VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和PlGF(Placenta growth factor)[29]。VEGF及其受体家族在细胞行为上具有复杂而精细的调控功能，除了与VEGF配体的多样性有关外，还与VEGF受体在种类上的多样性以及在功能上的多变性密切相关。经典的VEGF受体主要包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3[29,30]：VEGFR-2是调控血管生成的主要成员，在内皮细胞的存活、增殖、迁移中均发挥着不可取代的促进作用；另外，VEGFR-1与VEGFR-2相比，对VEGF的亲和力更高的同时对下游的激酶活性却更低，此特性赋予它通过竞争结合VEGF而对VEGFR-2功能的负向调节能力，VEGFR-1除了锚定在细胞膜上的全长形式，还有经过不同的剪接形成的可溶形式，即sVEGFR-1 (sFlt1)，已被证实是血管生成的负向调节因子，sFlt1在胎盘中的表达被认为参与了子痫前期的病理发生；VEGFR-3则是淋巴内皮功能的重要调节成员。另一类VEGF受体涵盖了壁板蛋白受体家族(Semaphorin receptor family)成员NRP-1(Neuropilin-1)和NRP-2 (Neuropilin-2)[29,31]：NRP作为壁板蛋白受体与神经轴突生长导向功能相关，作为VEGF受体则能够与VEGF和VEGFR共同构成三重复合体或者独立于VEGFR直接与VEGF作用，进而促进内皮细胞、肿瘤细胞等的迁移和侵袭活动。

Zheng等[32]通过对胶质瘤的研究，发现转染miR-15b模拟物后胶质瘤细胞的侵袭能力减弱，而转染miR-15b抑制物的细胞则出现相反的改变，同时NRP-2表达水平则随miR-15b的升高而降低，通过荧光素酶报告基因检测证实miR-15b以NRP-2 的mRNA为靶位，由此认为miR-15b能够通过在转录后水平上降低NRP-2的表达来减弱胶质瘤细胞的侵袭能力。Chan等[33]对人参皂苷促进血管生成机制的研究中运用类似的研究方法，证明miR-15b通过以VEGFR-2的mRNA为靶位降低VEGFR-2的表达水平进而减弱血管内皮细胞的成管能力。

当然，miR-15b对细胞增殖、凋亡、侵袭、成管等行为学的影响并不局限于以上路径。例如：Liu等[34]在有关心肌梗塞的研究中发现，向HUVEC(人脐带静脉内皮细胞系)转染miR-15b模拟物能够显著抑制低氧诱导的VEGF和Ang2的表达，因而认为VEGF和Ang2是miR-15b抑制该细胞成管活动的潜在靶位；Wu等[35]对HBV与肝细胞癌的研究中发现，由HBV引起的miR-15b下调通过岩藻糖转移酶-2(Fucosyltransferase-2)诱导Globo H表达的途径增强了肝细胞癌的增殖能力，而岩藻糖转移酶-2被证明是miR-15b的靶位；Marasa等[36]对MKK4(Mitogen- activated protein kinase kinase 4)增加与细胞的复制性衰老的研究中发现，MKK4是包括miR-15b在内的4种miRNA的联合靶位，同时MKK4增加可抑制细胞增殖并促使细胞出现衰老表型；对Pim-1激酶(Provirus integration site for Moloney murine leukemia virus 1 kinase)与结肠癌的研究中发现，Pim-1为miR-15b的靶位，而Pim-1扮演着原癌基因的角色[37]；对心肌细胞代谢的研究发现，miR-15b能够以Arl2为靶位致使线粒体退化并对细胞的ATP水平造成影响[38]。可见，miR-15b靶位多样，调节层次复杂，这种纵横交错的调节也是miRNA的共性。

2 miR-15b在血管相关性疾病中的研究现状

2.1 miR-15b与心血管类疾病发病机制的相关性研究

在心血管系统疾病中，发现由四肢动脉粥样硬化引起的外周血管疾病患者外周血miR-15b的含量有显著变化[39]；在心肌梗塞后的病理过程中，miR-15b则扮演抗血管生成的角色[34]；miR-15b通过对TGFbeta通路的抑制进而参与调解心肌肥大及间质纤维化的过程[40]。研究发现，患慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)的吸烟者较未患COPD的吸烟者，其肺组织miR-15b升高，并且表达水平与COPD金标准分级相关[41]；在辐射诱发的肺疾病支气管上皮细胞中，miR-15b参与调节p53磷酸化及DNA创伤反应的促进因子[42]。miR-15b也被证实参与代谢性疾病的发病过程，在晚期肾病患者血浆中检测到miR-15b含量降低，而这一表达水平的变化可能通过影响磷代谢相关基因而参与肾病的发展进程[43]；同时，在有关肥胖及糖尿病的研究中也发现了血清miR-15b含量的变化[44]，并且糖尿病患者伤口愈合能力受损被认为与异常升高的miR-15b对促血管生成因子的抑制作用有关[45]。

2.2 iR-15b及其家族成员与子痫前期的关系

Zhou等[46]将人类胎盘的发育过程形容成肿瘤发生和血管生成两大元素的结合。妊娠过程中，部分滋养层绒毛的滋养层细胞形成聚集体将孕体贴附到子宫壁上；随后滋养层细胞从这些聚集体长出并侵入蜕膜间质、子宫肌层的内1/3段、子宫螺旋小动脉；起初这些小动脉的管腔被滋养层细胞聚集体所堵塞，随着侵袭的进行，滋养层细胞替换掉部分母体血管内皮，同时间入血管肌织膜，将母体的这些小血管重塑为大管径低阻力的嵌合体血管，从而使胎盘小叶能够充分的浸泡在母体血液中[46,47]；显然，上述的胎盘发育过程是一个由活跃的滋养层细胞与内皮细胞的对话及细胞增殖、侵袭、成管等行为所组成的有序活动。

在胎盘发育中，有很多潜在的因素可能干扰参与此活动的细胞行为，进而对胎盘的结构或功能造成影响，最终导致妊娠不能顺利进行。子痫前期(Preeclampsia)即被认为是一种以胎盘着床表浅以及子宫螺旋动脉重塑障碍为主要病理机制的妊娠期疾病[48]。此病以孕20周以后的妇女新发高血压、蛋白尿为临床特点，或伴有母体其他多系统异常以及胎儿生长受限、羊水减少、胎儿缺氧等表现[49]，若得不到控制则可能发展成表现为抽搐状态的子痫[50,51]，作为一种十分常见的妊娠期高血压疾病而成为世界范围内孕妇和胎儿致病致死的主要因素。

胎盘发育过程与肿瘤发生过程中细胞的行为学特点有许多相似之处。越来越多的文献证实，在胎盘发育过程中miRNA可以通过外吐小体(Exosome)或与RNA结合蛋白AGO等结合释放到血液中。那么miR-15/16家族成员是否参与了胎盘的发育过程？在病生理条件下是否通过对滋养层细胞、血管内皮细胞的增殖、凋亡和其他功能的调节从而对胎盘发育相关细胞的生物学行为产生影响，进而参与到妊娠期疾病如子痫前期的发病机制中？其在胎盘或血浆中的表达变化是否对于重度子痫前期的发生具有预测意义？近年来国内外相关学者对此进行了深入的探讨。

Wang等[52]研究发现，miR-16在重度子痫前期患者蜕膜来源的间充质干细胞中表达水平明显升高，升高的miR-16不仅通过以cyclin E1为靶位抑制该细胞本身的增殖活动，还通过以VEGF-A为靶位抑制该细胞对人滋养层细胞以及人脐静脉血管内皮细胞迁移和成管能力的调节作用。相比之下，Bai等[53]的研究结果则揭示出miR-15b所在家族成员对细胞行为的逆向影响，发现miR-195能够通过以ActRⅡA为靶位反过来增强人滋养层细胞的侵袭能力，检测到在子痫前期胎盘组织中miR-195表达水平降低而ActRⅡA表达水平升高，认为升高的ActRⅡA与其在该疾病中同样升高的配体Nodal[54]共同作用减弱了滋养层细胞的侵袭能力。此外，Mouillet等[55]的研究显示，低氧刺激下miR-424在滋养层细胞中的表达水平降低，这种变化独特，既异于miR-424在非滋养层细胞中的变化，又异于此miRNA家族其他成员在滋养层细胞中的表现，同时证实在滋养层细胞中miR-424能以FGFR1为靶位，因而认为miR-424在滋养层细胞的分化中扮演了某种独特的角色。

2011年，Mayor-Lynn等[56]对子痫前期和早产患者胎盘组织miRNA以及mRNA表达谱进行研究，定量PCR检测发现子痫前期胎盘组织中miR-15b表达水平降低。然而，该研究只统计了5例正常对照及6例子痫前期的胎盘样本，且未计算值，因此对miR-15b在子痫前期胎盘中的表达仍需要进一步的研究。总之，miR-15b在滋养层细胞与内皮细胞等胎盘发育相关细胞的行为学有怎样的影响，在子痫前期的分子病理机制中又扮演着怎样的角色，这些都是亟待回答的问题。

综上所述，miR-15b作为miR-15家族的一员，通过以不同的mRNA为靶位在转录后水平调控相应基因的表达，从而在不同节点上对多种信号通路发挥干预作用，广泛影响细胞的增殖、凋亡、侵袭、成管等行为，最终参与到多种疾病的发生发展过程中。纵观miR-15b及其家族成员的异常表达与各类疾病的联系，涉及miR-15b与心血管发育的相关研究已十分丰富，同时有关miR-15家族其他成员与胎盘源性疾病的报道也在不断涌现，我们认为未来的主要发展方向在于：(1)目前的研究都是通过单个miRNA的功能失活或过表达的模式研究，而动物实验显示同一家族的不同成员之间，包括miR-15家族内都存在相似的调控通路的特点，如何在同一家族内鉴定出不同成员之间的调控关系及在细胞和组织水平对胎盘发育的影响，将是未来关注的焦点之一；(2)目前miR-15家族在内皮细胞对VEGF下游信号通路的影响较为明确，而探索是否对胎盘特异的VEGFR1(sFLT)的表达和分泌功能有影响，将有助于对该家族成员对胎盘发育的作用机制的理解；(3)该家族成员是否可以做为胎盘相关性疾病子痫前期的发生的早期分子标记物？对这些问题的深入探讨将对理解miRNA在胎盘发育的病生理过程的关键作用提供帮助。

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(责任编委: 方向东)

Roles of miR-15b in endothelial cell function and their relevance to vascular diseases

Liangju Chen1, Ming Yang1, Yan Chen1, Huaqin Sun1, Wenming Xu1,2

MicroRNAs (miRNAs) are noncoding RNAs with a short length of about 22 nucleotides. As major modulators participating in RNA interference, they affect cellular behaviors by regulating the expression of diverse genes at post-transcriptional levels. miR-15b is a member of the miR-15/16 family, which is broadly expressed in major tissues and specially enriched in the endovascular system of human beings. miR-15/16 affects cellular proliferation, apoptosis, invasion and angiogenesis. In this review, we summarize the role and the underlying mechanism of miR-15b as well as other miR-15/16 family members in different cells, especially in endothelial cells. We focus on the diverse roles of miR-15b in the occurrence, progression and prognosis of vascular diseases, with particular emphasis on preeclampsia, a hypertensive disorder related to endovascular dysfunction in the placenta.

miR-15b; proliferation; invasion; tumor; preeclampsia

2014-08-29;

2014-09-24

国家重点基础研究计划(973计划)(编号：2012CB944903)和新世纪人才计划项目(编号：NCET-12-0382)资助

陈良榉，硕士研究生，专业方向：出生缺陷。Tel：028-85502290；E-mail: 248698579@qq.com

许文明，副研究员，硕士生导师，研究方向：生殖生物学与生殖医学。E-mail: xuwenming1973@163.com

10.16288/j.yczz.14-288

网络出版时间: 2014-12-16 16:28:39

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141216.1628.002.html