Ts-SV40介导的温敏细胞研究现状

廖余平，李晓红，孙洪涛

综述

Ts-SV40介导的温敏细胞研究现状

廖余平，李晓红，孙洪涛△

非永生化细胞在体外的传代次数、增殖活性是有限的，在应用于细胞治疗或者是体外研究中会受到细胞数量的限制。转染有ts-SV40LT基因的细胞在许可温度下具有最大的增殖活性，在许可温度进行细胞扩增能弥补细胞数量不足的限制，非许可温度可用于细胞治疗或研究其生理特性。其研究领域涉及腹膜的间质细胞、泌尿道肌卫星细胞、口腔上皮细胞、肾上腺髓质细胞、骨髓血管内皮细胞、视网膜祖细胞、间充质干细胞、造血干细胞、肥大细胞、足细胞、库普弗细胞等。本文对ts-SV40介导的温敏细胞的研究现状做一综述。

转染；低温，人工；综述；ts-SV40；温敏细胞；亚低温；永生化

温度敏感猿猴病毒大 T抗原（temperature sensitive simian virus 40 large T antigen，ts-SV40LT）在许可温度下能促进细胞增殖，在非许可温度则抑制细胞增殖。在应用细胞移植治疗过程中，转染有ts-SV40LT基因的细胞在体外许可温度下进行扩增以弥补移植细胞不足的限制，移植到体内后在非许可温度实现细胞或基因治疗的作用。本综述旨在概述ts-SV40LT基因的作用机制、涉及研究领域及应用。

1　研究背景

SV40属多瘤病毒家族，是20世纪60年代初由Sweet和Hilleman从猴肾细胞中分离得到的一种DNA病毒。SV40基因组是一条单拷贝双链、环状、超螺旋DNA，由调控区、早期编码区和晚期编码区3个不同的功能区组成。早期编码区编码3种蛋白：位于核内的LT抗原、小T抗原和17KT。合成的LT抗原蛋白98%定位于细胞核内，是具有ATP酶和DNA解旋酶活性的多功能磷酸蛋白，能够促进宿主细胞进入S期。由于干预了细胞周期控制，LT抗原就代表了SV40的主要转化蛋白。

非永生化细胞体外每经过一次细胞周期端粒就缩短一次，并逐渐失去分裂能力，趋向凋亡。细胞永生化是指细胞获得持续生长增殖能力的特性，永生化细胞具有无限增殖生长的特性，可长期传代并多伴有核型改变［1］。端粒酶的激活可使端粒长度保持相对稳定，从而使细胞获得永生化。自然状态下啮齿类动物自发永生化的概率非常小，为1×10-6～1× 10-5，人类细胞发生的概率更是小于1×10-12。因此，要使用各种物理和生物因素诱导细胞发生永生化，其中SV40LT抗原是非造血细胞永生化最常用的成分［1-2］。SV40LT基因感染宿主细胞并与宿主细胞DNA稳定整合重组后能在细胞内表达SV40LT抗原，加快转化细胞的增殖速率，同时也能保留原始细胞许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，在细胞水平上可反映原始细胞的生物学特性。

2　SV40介导永生化的机制

虽然SV40是基本的病毒性致癌物质，作为永生化的常用基因片段其LT抗原基因也已被确认为癌基因，但SV40病毒引起细胞转化和发生永生化仍然是一个复杂的过程，其机制尚不完全清楚，多认为是诸多因素共同参与和调控的结果。在诸多的因素中，p53和pRb与SV40LT抗原所介导的永生化最为密切，研究也最多。由393个氨基酸组成的核磷蛋白基因编码的p53具有转录因子作用，野生型p53在细胞周期G1期停滞时能检测DNA的完整性，并通过其过度表达诱导受损的细胞凋亡，以确保DNA复制的完整性，如果p53基因发生突变，则失去细胞周期G1检查点功能［3］。LT抗原可以与p53结合形成复合体使p53失活，在对SV40转化的大鼠细胞中LT抗原磷酸肽分析以及对SV40裂解性感染细胞的分析表明，游离的LT抗原与和p53结合的LT抗原有不同的磷酸化方式，最显著的差别就是p53复合体的LT抗原不含磷酸肽。这些磷酸肽是由小鼠双微体基因（murine double minute 2，MDM2）衍生来的，MDM2是p53拮抗剂，可能与p53-LT复合而形成p53-LT-MDM2三聚体发生共沉淀。MDM2在SV40转化的细胞中与游离p53大量结合，而游离的LT抗原不与MDM2复合，提示MDM2蛋白与LT抗原有一个特殊的靶识别途径。这一特殊途径由于MDM2蛋白在正常细胞和SV40转化细胞中显著不同的磷酸化方式而显得更突出。另外，与p53一样，MDM2蛋白在SV40转化细胞中代谢稳定，这提示通过SV40这一特殊靶识别途径的目的在于抑制SV40转染或转化细胞中的由MDM2诱导的p53蛋白酶体降解，从而使这些细胞中p53代谢稳定［4］。

3　温度敏感细胞的特征

SV40温度敏感突变体指的是温度依赖而发生构象改变的LT抗原基因，在许可温度下能促进细胞增殖，在非许可温度则抑制细胞增殖。ts-SV40LT基因包含一个单核苷酸突变而导致缬氨酸在非许可温度发生构象改变［5-6］。

野生型SV40LT抗原通过灭活一些肿瘤抑制因子如p53、pRb等保持细胞的永生化［7-8］。ts-SV40LT是SV40LT抗原突变等位基因，许多从转导该基因动物提取的细胞系呈现出温度依赖的生长特点，在非许可温度下细胞分化或生长停止而出现凋亡［9］。刘洪良等［10］认为尽管其细胞呈现温度敏感生长特点，在非许可的39℃LT抗原及S期标志物增殖性细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的含量并没有明显下降。细胞周期分析提示在39℃位于G1前期时间明显增加，代表细胞凋亡标志的S期下降，因此认为细胞的永生化及增长归因于ts-SV40LT抗原的持续表达。

Kim等［11］利用ts-SV40LT抗原温度敏感性特性让细胞在37～39℃条件下培养一段时间灭活LT抗原，危机期逃逸细胞将在几代内逐渐死亡。但仍有约0.053%～0.093%的细胞能够进入S期，对温度不再敏感得以继续生存，尽管这些细胞端粒酶持续表达，端粒长度保持恒定，但染色体损伤不能避免。这就提示使用这些细胞必须谨慎，因为其在临床应用时可能出现不可预料的表型变化。

Ts-SV40LT在许可的33℃能与p53及pRb形成复合体促进细胞增殖，但在非许可温度，ts-SV40LT迅速被灭活并从其复合物中释放pRB或p53［12-13］，细胞停留在G1或G2/M期［14］，刘洪良等［10，15］利用ts-SV40LT的温度可调控特性建立一种温度敏感的干细胞系，发现该细胞在其适宜温度（33℃）下大部分处于S期，但当其处于37℃环境中时多停滞于G1期。这就提示在适宜温度下细胞呈现LT抗原促进细胞增殖的特点，在非适宜温度呈现LT抗原灭活的作用。然而，在非许可温度细胞的分子机制仍需要进一步探索。

4　温敏细胞目前应用

4.1间皮细胞的腹膜损伤修复研究随着腹膜透析的广泛推广，由此产生的腹膜损伤发病率也增高，间叶细胞移植治疗可能是一种有效的治疗方法。Kanda等［16］通过ts-SV40转基因大鼠建立温敏间叶细胞系进行了诱导间叶细胞向成纤维细胞分化的研究，该细胞系在33℃呈现细胞增殖活性，于38℃环境培养时细胞增殖停止并趋向分化，不仅实现了细胞表型的改变，也实现了成纤维细胞的生物作用，该研究发现间充质干细胞自身分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有成纤维化及趋化作用，但间充质干细胞移植治疗腹膜损伤的安全性及有效性有待进一步评估，其中就包括腹膜原位移植间充质干细胞的数量或次数探索［5］。

4.2诱导泌尿道括约肌卫星细胞肌源性分化研究前列腺切除术后尿道括约肌损伤易导致尿失禁。Sumino等［17］研究不同生长因子对泌尿道括约肌卫星细胞分化的影响。将人肌卫星细胞转导ts-SV40LT后于33℃环境下培养进行细胞扩增，在39℃诱导其分化。其研究发现肝细胞生长因子（hepatocyte growth，HGF）不能诱导卫星细胞的肌源性分化，胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）通过PI3-K途径诱导卫星细胞分化为肌源性细胞［18］。这些发现提供了一种可能的新方法，即利用肌卫星细胞用于尿失禁治疗。

4.3鼠科口腔上皮细胞增殖的分化研究上皮组织具有分隔外界环境，保护组织不受外界病菌侵入的作用。Tabuchi等［19］通过转导有ts-SV40基因胎鼠建立永生化的口腔上皮细胞系，其细胞在33℃或中间温度37℃呈现出细胞增殖的特点，在非许可的39℃增殖停止并呈现凋亡的迹象。组织学及免疫组织化学分析表明细胞在37℃具有分层上皮样细胞形态改变特点，免疫分析表明其细胞表达有口腔上皮细胞特异性标记的多层鳞状角化蛋白。可以预期这个细胞系将被用作体外模型研究如上皮细胞生理学功能、口腔上皮基因表达及上皮组织修复研究。

4.4肾上腺髓质细胞向神经元细胞的分化诱导Murata等［20］利用转染有ts-SV40基因的大鼠建立了一个肾上腺髓质细胞系，细胞在33℃的许可温度时在胶质细胞神经源性生长因子（glial cell line-derived neurotropic factor，GDNF）等营养因子的作用下细胞数增长。非许可的39℃时在GDNF等营养因子的作用下分化为神经元样细胞。其研究表明，转基因细胞在温度变化时，可将其癌基因灭活，并在GDNF和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的同时作用下具有终末分化为神经元样细胞的能力。该细胞系提供了一个实用的可用于神经元分化调节机制研究的系统模型。

4.5骨髓血管内皮细胞向血管组织的分化组织内皮细胞移植修复主要考虑从大血管如脐静脉分离及培养内皮细胞。然而，这些细胞模型的建立尚存在某些限制，例如与预期寿命相比其增殖潜力有限，在功能表现上具有易变性。Hattori等［21］从ts-SV40转基因鼠骨髓分离单核细胞后于37℃将其诱导为分化型内皮细胞（endothelial cells，ECs），接下来转移到ts-SV40LT许可的33℃培养基进行培养，通过RT-PCR可检测到VEGF、VEGF受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、血管性血友病因子（von Willebrand，vWF）的分泌表达。应用ts-SV40转基因大鼠提取的各种细胞将可能用于检测内皮细胞与器官或组织的相互作用，并可能通过这些细胞作为基因治疗的运载工具用于抑制或活跃血管原位再生。

4.6应用人类胎儿视网膜永生化细胞治疗视网膜疾病人类胎儿的视网膜细胞被广泛用于视网膜退行性变的细胞替代治疗，其应用的一个主要缺陷就是缺乏足够的持续细胞来满足治疗需求。Hasan等［22］利用携带有ts-SV40LT基因的逆转录病毒转染视网膜祖细胞获得温敏视网膜细胞系，对该细胞系于33℃培养进行细胞扩增，于37℃诱导其分化。为了评估这些细胞与病变细胞的相容性并屏蔽其潜在的致瘤性，将其移植到新生正常鼠及视网膜病变鼠中，两组的移植细胞表现出与受体鼠罕见的相容性，但没有表达成熟的分化表型。尽管移植的永生化细胞呈现出较高的生存率，但其生存时间不长，最终所有的移植细胞都被巨噬细胞或小胶质细胞吞噬。这项研究表明，永生化的胎儿视网膜细胞能保持其祖细胞的特点，可能作为移植供体细胞治疗视网膜退行性疾病。

4.7应用温敏干细胞联合亚低温治疗急性颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI） 干细胞移植对TBI具有潜在的治疗作用。然而，TBI后缺氧微环境以及毒素积累可导致移植细胞存活率不高，从而限制其临床应用，亚低温治疗具有改善TBI后微环境的作用。Tu等［23］推测温敏干细胞联合亚低温具有促进移植细胞存活的作用，尤其是在亚低温下呈现最大活性的温敏干细胞，在这项研究中，运用质粒携带ts-SV40基因转导的间充质干细胞用于TBI治疗，对大鼠认知及运动功能的改善与对照组相比更加明显。神经干细胞移植后功能恢复需要一定的时间，需要新分化的神经元成熟并且与受体整合，但温敏脐带间充质干细胞分化为神经元尚需进一步研究。

4.8其他肥大细胞（mast cells，MCs）在体内广泛分布于黏膜组织，在抵抗寄生虫及细菌侵入时具有较高的敏感性，甚至可造成过敏反应及自身免疫性疾病。研究MCs的调控及作用机制对治疗由MCs异常引起的疾病显得尤为重要。Kanehira等［24］从转导有ts-SV40大鼠的骨髓提取MCs，研究其在某些刺激因子作用下的细胞形态学及生物化学变化特点，促进了MCs体外分化及功能研究。Oostendorp等［25］利用ts-SV40转基因大鼠造血基质细胞用于造血因子的表达研究，发现转染有ts-SV40基因的胚胎干细胞的生长及克隆活性增加。Chittiprol等［26］利用ts-SV40介导永生化足细胞系研究其在不同条件下基因表达、细胞形态学特点。Herman-Edelstein等［27］利用ts-SV40介导永生化足细胞用于糖尿病肾病研究，Wang等［28］利用ts-SV40转基因大鼠用于库普弗细胞（Kupffer cell，KC）的体外研究，转染有ts-SV40的KC保持了原始KC的特性，提供了一个适宜的方法评估KC在肝损伤以及慢性疾病中的角色。

5　展望

Ts-SV40在许可温度下能促进细胞增殖，在非许可温度下则抑制细胞增殖。利用其在许可温度促进细胞增殖的特点，将其应用于细胞移植治疗，转染有ts-SV40LT基因的细胞在体外许可温度下进行扩增可以弥补移植细胞不足的限制，移植到体内后在非许可温度下实现细胞或基因治疗的作用；在应用于非永生化细胞体外研究中，可通过转染ts-SV40LT基因于许可温度进行细胞扩增、非许可温度研究其生理特性。其涉及研究领域广泛，但分子机制尚不完全明确，多次传代之后其细胞分化潜能、形态学及功能改变、潜在的致瘤性仍然是其应用的主要障碍，其安全性及广泛应用有待进一步探索。ts-SV40转染细胞在33℃有最大的增殖活性，与亚低温治疗的温度相契合，可能是一个新兴的研究方向。

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（2014-05-23收稿2014-11-13修回）

（本文编辑魏杰）

Research status on Ts-SV40-mediated temperature sensitive cells

LIAO Yuping，LI Xiaohong，SUN Hongtao△
Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology，Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair，Tianjin 300162，China
△Corresponding AuthorE-mail:chenmo333@163.com

The in vitro passage number and proliferation of non-immortalized cells are limited，which restrictions cell therapy or in vitro studies.Cells transfected with temperature sensitive simian virus 40 large T antigen（ts-SV40LT）gene could show the greatest proliferation.The cells can be amplified with compensating the lack of limited number of cells under the permissive temperature.Non-permissive temperature can be used in studying the cell therapy or its other physiological characteristics.This research field involves peritoneal stromal cells，satellite cells of urinary tract，oral epithelial cells，adrenal medullary cells，bone marrow-derived endothelial cells，retinal progenitor cells，mesenchymal stem cells，hematopoietic stem cells，mast cells，podocytes and Kupffer cells.In this study，the current research on Ts-SV40-mediated temperaturesensitive cells was reviewed.

transfection；hypothermia，induced；review；ts-SV40；temperature sensitive cells；hypothermia；immortalization

Q28

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.027

国家自然科学基金资助项目（81471275，81271392，81341113）

天津，脑创伤与神经疾病研究所，武警后勤学院附属医院脑科医院，天津市神经创伤修复重点实验室（邮编300162）

廖余平（1989），男，硕士在读，主要从事中枢神经创伤修复研究

△E-mail:chenmo333@163.com