激光共聚焦扫描显微镜技术在脑卒中针刺机制中的应用进展

许秀洪，洪金妮(综述)，周国平(审校)

(1.南方医科大学中西医结合医院针灸推拿科，广州 510515； 2.南方医科大学中医药学院，广州 510515)



医学影像学

激光共聚焦扫描显微镜技术在脑卒中针刺机制中的应用进展

许秀洪1△，洪金妮2(综述)，周国平1※(审校)

(1.南方医科大学中西医结合医院针灸推拿科，广州 510515； 2.南方医科大学中医药学院，广州 510515)

摘要：激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)作为一种非侵入性图像分析仪器，有标本制备简单、分辨率高、实时动态成像等特点，可清晰地对活体细胞进行无损伤性动态观察、空间定位、定量检测等。针刺疗法治疗脑卒中具有良好的临床疗效，其机制研究也越来越受到重视。CLSM作为新一代的研究工具，也广泛应用于针刺机制的基础研究中，该文就CLSM技术在脑卒中针刺机制研究中的应用情况予以综述。

关键词:脑卒中；激光共聚焦扫描显微镜；针刺

激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)是20世纪末推出的高精度医学图像分析仪器，CLSM是在荧光显微镜基础上，集普通光学显微镜、激光、电子、计算机技术和图像处理技术于一体的现代高科技产品，与传统光学显微镜相比，共聚焦显微镜分辨率高，在实现多重荧光观察的同时形成清晰的三维图像，在生命科学中被誉为“细胞CT”。祖国医学的针刺治疗，在脑卒中的治疗中具有良好的临床疗效，运用各种现代先进的科学技术，研究针刺治疗脑卒中机制，已成为针刺机制研究的重要途径，CLSM就是采用的先进设备之一。现就近年来CLSM技术在针刺治疗脑卒中研究中的应用情况予以综述。

1CLSM的基本原理和应用

1.1CLSM的基本原理CLSM以激光作为光源，激光通过针孔聚焦到达样本的某深度，形成一个点光源，点光源对样本内聚焦平面上的每一个点进行扫描，样本上的被照射点在检测针孔上达到成像平面，由倍增管在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。光源针孔与检测针孔的位置相对于焦平面是共轭的，聚焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，聚焦平面以外的点不会在检测针孔中成像，这样得到的共聚焦图像是样本的光学横断面，得到的是高清晰度、高分辨率的图像，同时激光可以调节聚焦的深度，可进行X、Y、Z三轴的扫描，将这些轴上形成的图像经过计算机软件分析重建后，可获得该样本任意平面的图像或者三维立体图[1]。

1.2CLSM在医学研究中的应用CLSM在各种免疫荧光探针、染料的辅助下，与被检测物质特异性结合后可观察到固定的生物细胞组织切片，活体细胞的结构、分子、离子的动态变化。在生命科学领域的中常应用于：①细胞组织内生物大分子的原位鉴定，细胞及亚细胞形态结构的观察，如在细胞原位检测核酸、蛋白质、抗体及其他分子；检测细胞凋亡、细胞器、细胞融合、细胞骨架、细胞间缝隙连接通讯等。②活体细胞或组织功能的实时动态监测，如实时定量测定细胞内Ca2+、pH、活性氧物种的产生及膜电位的变化等[2-4]。

2CLSM在针刺治疗脑卒中研究中的应用

2.1组织、细胞与亚细胞的观察CLSM不仅简化了传统光镜的研究程序，同时可精确聚焦到较厚的切片甚至是组织的深部，庄明华等[5]和白晔等[6]运用CLSM观察在正常状态下活体家兔大脑皮质内血管内的轴流、缘流厚度和血管口径的变化，随后作针刺处理，再进行生理状态下和针刺后的对比，结果表明电针刺激能引起家兔动脉的舒缩运动，其舒缩运动的结果随着血管口径大小的不同而有所差别，证明针刺可改变大脑循环血流量，通过微循环的改善进而增加缺血脑组织能量供应，改善缺血后组织细胞的代谢，减轻脑组织细胞的损伤。张金铃等[7]采用D-273内质网荧光分子探针，通过CLSM动态扫描观察，对比加入正常大鼠血清和电针2周后大鼠的血清，发现针刺2周后的血清能抑制神经元内质网活性的下调。

杨福霞[8]运用携带有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的反转录病毒pLXSN，利用CLSM观察大鼠缺血部位侧脑室下区EGFP细胞和EGFP/巢蛋白双标细胞的表达、缺血处海马齿状回EGFP阳性细胞和EGFP/神经特异性烯醇化酶双标细胞的表达。观察并计算其实验结果后表明针刺任脉能促进缺血大鼠神经干细胞的分化与增殖。刁利红等[9]在电针刺激任脉和肌内注射碱性成纤维细胞生长因子的实验中，利用CLSM观测局灶性缺血模型大鼠原位神经干细胞增殖情况，也得出针刺可促进大鼠脑缺血后神经干细胞的增殖。

于海波等[10]利用CLSM观察电针任脉腧穴对于局灶性脑缺血大鼠损伤侧海马星形胶质细胞的转归是否有正向影响的实验中，观察大鼠损伤侧海马胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞以及胶质纤维酸性蛋白/神经元特异性烯醇化酶双标阳性细胞的形态和数量后得出：电针刺激任脉可调节缺血后大鼠海马增殖的星形胶质细胞，抑制其过度增殖，促进它的多潜能化，有利于脑缺血后的神经修复，这一结果与Lin和Matesic[11]的实验结果相符。罗燕等[12]运用CLSM观察大鼠皮质缺血灶周围区不同时间段星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白免疫活性反应的变化发现，电针可减轻缺血引起的星形胶质细胞结构性损伤,下调胶质细胞内胶质纤维酸性蛋白的过度表达，推断电针改善脑缺血的作用可能与其干预星形胶质细胞的活化状态有关。

2.2Ca2+水平的测定Ca2+作为细胞内的第二信使，是细胞接受外界刺激或生物活性物质作用后引起生物学反应的重要桥梁，有学者利用CLSM技术和活体脑片负载技术,研究局灶性脑缺血和缺血/再灌注后大鼠海马CA1区Ca2+变化及针刺调节Ca2+的变化，发现急性局灶性脑缺血和缺血/再灌注后大鼠海马锥体细胞Ca2+随着时间的延长呈增高趋势，在再灌注6 h后胞内Ca2+达到高峰，此后有下降趋势，但仍高于缺血前水平，验证了临床上脑缺血在6 h的有效时间窗内采取多方面多水平的干预措施，对脑损伤的归转至关重要。也证实了针刺降低缺血区海马CA1区锥体细胞内Ca2+,抑制了钙超载，从而保护脑缺血后神经元的损伤[13-16]。杜亦旭[17]通过CLSM观察发现电针刺激可降低缺血后皮质和纹状体细胞内Ca2+水平，抑制缺血引起的星形胶质细胞钙超载，促进星形胶质细胞与神经元间的信息传递，使其逐步恢复协调，从而有助于减轻脑缺血后继发性神经元的损伤。

张金铃等[18]从血清学和细胞学角度，取海马细胞进行原代培养后应用钙荧光分子探针Fluo-3 AM染色，运用CLSM动态扫描，观察加入正常大鼠血清和电针2周后的血清对海马细胞内Ca2+的影响。结果表明，加入针刺血清可降低升高的细胞内Ca2+水平。黄长军等[19]采用CLSM和分子探针技术，对针刺通过颅脑损伤大鼠血清影响SY5Y细胞Ca2+进行研究。同样得出电针可减慢脑损伤大鼠脑组织Ca2+水平的上升趋势、抑制细胞内Ca2+滞留和超载的结论。

2.3信号通路的研究陈小娱[20]用CLSM对免疫荧光双标的缺血脑片进行双通道断层扫描,观察脑缺血/再灌注24 h后大鼠大脑皮质胱天蛋白酶3(caspase-3)阳性细胞荧光强度的变化。双通道扫描图像重叠后显示，caspase-3主要在神经元胞质内表达，在细胞核有少量的表达，电针组中caspase-3阳性细胞的平均荧光强度较脑缺血/再灌注组中的明显下降,较对照组中的平均荧光强度强，提示针刺治疗可有效下调caspase-3的表达，抑制细胞凋亡的发生。罗文舒等[21]通过CLSM观察针刺督脉经穴对局灶性脑缺血大鼠脑组织核因子κB 蛋白表达的影响，结果表明针刺督脉经穴抑制脑缺血/再灌注大鼠急性期核因子κB的过度表达，减少细胞凋亡，减少炎症反应，改善脑缺血/再灌注损伤。孙宁[22]应用整体脑缺血/再灌注模型，对N-甲基-D-天冬氨酸受体和酪氨酸激酶受体在针刺治疗脑缺血/再灌注损伤中的作用以及两者之间的相互关系进行探讨。电针治疗后应用免疫荧光标记技术，CLSM下观察电针治疗对缺血区大脑皮质酪氨酸激酶表达的影响。结果显示，脑缺血/再灌注损伤后，电针治疗可以上调缺血区大脑皮质酪氨酸激酶受体的表达，同时，也可抑制缺血损伤诱导的N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位NR1的异常表达，电针的神经保护效应可能通过酪氨酸激酶-磷脂酰肌醇3-激酶通路介导，通过该信号通路增强负性转录因子NRSF与N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚单位基因的结合能力，从而在转录水平上抑制NR1的表达。刘荣[23]对JAKs激酶在电针抗缺血性脑损伤中作用的研究，采用免疫荧光染色法结合CLSM，观察电针对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区不同时间段缺血侧皮质JAKs激酶及其转录激活因子的影响，表明电针治疗的介入能显著提高脑缺血早期缺血侧皮质JAK1的活性,激发机体自我保护机制，减轻脑缺血损伤，且能促使这种保护性的效应维持一段较长的时间,参与受损组织的修复。

3小结

CLSM的应用开创了细胞生物学更深层次的研究，作为一项强有力的研究工具与技术，能更精准地从脑组织、细胞及亚细胞结构的形态学、离子浓度变化、信号因子等方面来研究针刺抗脑卒中发展的可能性机制。针刺抗脑细胞凋亡方面的研究是近来研究的热点，其机制是一个庞大而复杂的网状关系[24-25]。随着CLSM技术的应用，针刺机制的研究也深入到信号通路方面，虽然大多只是对某一信号因子的研究，但也提示要利用好CLSM的优势,从信号因子或信号通路方面来探究针刺机制，且重视彼此间的相互关系，在整体中研究与分析各种信号传递的相关性，为针刺治疗脑卒中提供理论基础。

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The Advances of Applications of Confocal Laser Scanning Microscope in Studying the Therapeutic Mechanism of Apoplexy with Acupuncture

XUXiu-hong1,HONGJin-ni2,ZHOUGuo-ping1.

(1.AcupunctureandMassageDepartment,TCM-IntegratedHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2.TheschoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:Confocal laser scanning microscope(CLSM)is a new,non-invasive image analyzer,characterized with real-time high resolution imaging and simple specimen preparation,it is a new research tool in the study of morphology,molecular biology,neuroscience and so on.Acupuncture therapy is effective for the treatment of Apoplexy and more and more attention is focused on the research of its mechanism.CLSM is widely applied in the study of therapeutic mechanism of cerebrovascular disease(CVD) treated with acupuncture.Here is to make a review of the advances of applications of CLSM in studying the therapeutic mechanisms of CVD treated with acupuncture.

Key words:Cerebrovascular disease； Confocal laser scanning microscopy; Acupuncture

收稿日期：2014-05-04修回日期：2014-08-15编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81173355)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.08.037

中图分类号：R332; R331

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)08-1441-03