RECK基因抑制肿瘤作用的研究进展

查从亮（综述），江 浩（审校）

（蚌埠医学院第一附属医院肿瘤放疗科，安徽蚌埠 233000）

恶性肿瘤的一个重要特征即是侵袭和转移，找到控制恶性肿瘤侵袭和转移的方法是目前很多研究者努力的方向，近年来发现的一种转录抑制基因为反转录富含半胱氨酸蛋白（reversion-inducing cystein-rich protein with kazalmotifs，RECK）基因，其抑制肿瘤侵袭及转移的作用是通过抑制多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达而实现。在肿瘤的侵袭和转移中最重要的步骤为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解与基膜重构。从原位癌发展到浸润性癌的过程中，基膜破坏是最重要的因素。肿瘤细胞局部浸润和转移即可通过黏附至基膜及ECM的方式而逐步实现。研究表明，MMPs对肿瘤细胞的黏附和能动性产生影响，其参与ECM的降解以及新生血管的形成，其中肿瘤的侵袭及恶性程度与MMP-2的表达水平密切相关，此为肿瘤生物学特性的一个重要影响因素［1-3］。近年来，对MMPs抑制剂的研究已广泛开展，但却没有明显提高患者的总体生存率，加上其不可避免的不良反应，临床大规模的应用有待进一步研究。目前发现，蛋白水解酶中一个最重要的家族为MMPs［4-5］，有超过20种，依据其序列和降解底物的不同，可将MMPs分为间质降解素、膜型MMPs、胶原酶、基质溶解因子和明胶酶五大类。而目前对RECK及MMPs的功能的认识还不完善。现就RECK的结构、功能，RECK与各种肿瘤的相关性，RECK在肿瘤侵袭及转移中的作用予以综述。

1 RECK的结构及表达

Takahashi等［6］向小鼠的纤维原细胞（NIH3T3）中转染v-Ki-ras基因进而克隆到一个新基因——RECK。RECK基因定位于人类染色体9p12～13，包含有21个外显子，20个内含子，整个基因长度约87 kb，其中9个位于内含子区域（含子5，8，10，12，15，17），4 个位于基因编码区域（外显子 1，9，13，15），共13个单核苷酸多态性，其转录子的碱基数为 4.6 kb。RECK互补DNA编码的膜锚定糖蛋白，其相对分子质量为110 000，由971个氨基酸共同组成。其具有一些共同的蛋白序列结构:①在其NH2－端具有5个潜在糖基化位点，有2个表皮生长因子样重复序列及5个半胱氨酸结重复结构;②是一种蛋白水解酶抑制结构，其含有3个丝氨酸且完全符合Kazal模体结构;③富含丝氨酸，其COOH－和NH2－端各有一个疏水区，其糖基化锚定信号点在COOH－端，RECK通过磷脂酰肌醇被固定于细胞膜上;④RECK编码的糖蛋白二级结构复杂，因其含有丰富的丝氨酸（9.2%）。研究表明，定位于第9号染色体短臂上9p12～13区域的RECK基因，与许多肿瘤的发生、发展关系密切，且多种癌基因可调控RECK基因的表达。研究表明，ras可通过组蛋白的脱乙酰基和DNA的甲基化作用而达到抑制RECK表达的目的［7］。鼠的内源性RECK基因在无ras转染的NIH3T3细胞中可表达正常，而在有ras转染的细胞株中表达会显著下降。RECK的启动子活性区位于其上游的52-碱基区域，在该区可见2个Spl结合位点，一个是CAAT盒，另一个是1个CEBP的结合基元。虽然这2个Spl位点与Sp1和Sp3转录因子都可以结合，但能与ras相互作用的只有一个。进一步的研究表明，ras下调RECK的表达是通过调节Spl/Sp3转录因子的转录活性而实现。活化的ras可通过对Spl/Sp3的糖基化或者磷酸化来调节其结构，再作用于它们的调节蛋白，从而实现对RECK基因表达的抑制［8］。另有研究显示，在细胞株中转染了其他癌基因（c-myc，v-mos，v-fes，v-src，v-fos）后，RECK 基因表达量明显下降，表明多种癌基因可参与负向调控RECK基因的表达。

2 RECK与肿瘤关系

2.1 鼻咽癌 邓燕飞等［9］通过原位杂交技术检测了60例原发性鼻咽癌患者（颈淋巴结转移组30例和无颈淋巴结转移组30例）、鼻咽癌颈部转移淋巴结10例和慢性鼻咽炎组织20例中RECK的信使RNA表达情况，结果发现，鼻咽癌伴颈淋巴结转移组的阳性表达率明显低于无颈淋巴结转移组及慢性鼻咽炎组织。同时显示，鼻咽癌中RECK基因的异常表达和患者的颈淋巴结转移、复发及治疗后5年生存期有关，且两者表达呈负相关，但与患者的性别、年龄、T分期及临床分期无关，从而提示RECK基因异常表达可能与鼻咽癌的进展有关，参与了鼻咽癌的侵袭转移过程。RECK可作为评估鼻咽癌颈淋巴转移及复发的生物学参考指标。

2.2 小细胞肺癌 王茺茺等［10］采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（SP法）来检测43例肺癌组织和10例癌旁的正常肺组织中RECK和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达水平。结果显示，小细胞肺癌癌组织中RECK蛋白的表达低于癌旁的正常组织，而且RECK在肺癌组织的低表达可促进VEGF诱导的微血管的形成，RECK与肺癌的血管的生成密切相关，从而提示，RECK基因与小细胞肺癌的侵袭及转移可能存在一定关系。

2.3 食管癌 孙晓宏等［11］采用反转录聚合酶链反应（reverse pdymerase chain reactim，RT-PCR）方法检测90例食管鳞状细胞癌和其癌旁组织中RECK基因转录水平的差异，同时观察RECK和食管癌的分化程度、肿瘤的浸润深度以及淋巴结转移之间的关系。结果显示，癌旁组织RECK的转录水平要高于癌组织;且食管癌组织的分化程度、肿瘤的浸润深度、淋巴结的转移以及临床分期均与 RECK基因的转录水平呈负相关。因此提示，RECK可能与食管癌的发生、发展以及转移相关，RECK可作为独立的生物分子指标判断食管癌的预后。

2.4 胃癌 Du等［12］采用甲基化特异性PCR分别检测40例胃癌组织、淋巴结组织、腹腔冲洗液及其癌旁正常黏膜RECK基因的甲基化水平的差异。结果显示，癌旁正常黏膜RECK基因的甲基化率为27.5%（11/40），胃癌组织中RECK基因的甲基化率为47.5%（19/40），淋巴结组织RECK基因的甲基化率为57.1%（12/21），腹腔冲洗液中RECK基因的甲基化率为35%（14/40），在原发肿瘤样本中存在的RECK基因甲基化与肿瘤细胞的浸润显著相关。这提示RECK的表达可对胃癌腹腔内转移的早期诊断及治疗提供依据。

2.5 骨肉瘤及软骨肉瘤 Clark等［13］在对骨肉瘤的研究中证实在骨肉瘤组织中RECK信使RNA的表达缺失，但在肿瘤血管内皮细胞中呈过度表达，进一步研究其与VEGF的关系后发现，在低分化的骨肉瘤中，RECK与VEGF呈负相关，RECK可抑制骨肉瘤的侵袭、增殖和集落细胞的形成以及破骨细胞的活性。

2.6 妇科肿瘤 王玲等［14］用细胞计数、免疫组织化学和测量灰度值的方法研究48例宫颈正常上皮、慢性宫颈炎组织（对照组）与52例宫颈癌组织（试验组），结果显示，正常的宫颈组织中RECK基因的表达显著高于宫颈鳞癌组织。试验各种组织中的微血管密度值明显高于对照组。可见，RECK基因在宫颈癌组织中低表达，且可抑制其微血管形成。刘晶晶等［15］通过PCR方法检测发现42例子宫内膜癌肿瘤组织中RECK基因的表达要比子宫内膜不典型增生及正常子宫内膜组织低;相反地，子宫内膜癌肿瘤组织中MMP-9的表达水平则较高，结果显示RECK的表达水平与MMP-9的表达之间存在负相关性，即随着MMP-9的增强，RECK表达量反而降低。RECK的表达缺失可能与妇科肿瘤发生及浸润转移相关。

2.7 神经胶质细胞瘤 史益男和徐飞［16］以59例脑胶质瘤患者病变组织和癌旁相对正常脑组织为研究对象，通过制作组织微阵列技术及采用免疫组织化学法，检测RECK基因在脑胶质瘤组织中的表达情况及临床意义，在正常脑组织中RECK蛋白高表达率明显（18/19、94.7%），而在胶质瘤中该RECK的表达下调为69.4%，另有30.6%的胶质瘤组织中RECK的表达较正常脑组织中显著降低，两者间差异有统计学意义;在Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ病理分期中该蛋白的表达率分别为81.2%、55.0%，两者之间的差异有统计学意义;结果显示RECK基因在脑胶质瘤组织与癌旁相对正常脑组织中的表达呈现逐渐上升的趋势，且RECK在病理分级间的表达差异也有统计学意义，因此其可能作为一个分子指标来判断脑胶质瘤的病变程度。

2.8 结肠癌 朱振新等［17］采用RT-PCR的方法检测40例结肠癌和其癌旁组织中MMP-2、MMP-9及RECK基因的表达水平并作相对定量分析。研究发现与癌旁组织相比，结肠癌组织中RECK基因的表达水平较低，而MMP-2、MMP-9的表达水平较高。且RECK基因的阳性表达率会随着结肠癌组织学分级的升高而升高;同时研究表明肿瘤的分化程度、淋巴结转移及TNM分期和RECK基因的表达密切相关，在结肠癌病变组织中，RECK基因的表达与MMP-2、MMP-9的表达呈负相关，从而提示RECK基因通过对MMP-2、MMP-9表达的抑制，可能在结肠癌的发展中实现抑制结肠癌的进展。

2.9 肾癌 傅全胜等［18］采用免疫组织化学的方法对57例肾细胞癌患者中MMP-9和RECK基因的表达情况进行研究，结果表明在肾细胞癌组织中RECK基因的阳性表达率为47.4%，显著低于癌旁的正常组织，而MMP-9在肾细胞癌组织中的阳性表达率为80.7%，显著高于癌旁的正常组织。且MMP-9及RECK基因的蛋白表达与肿瘤的组织学分级、临床病理分期及淋巴结转移情况关系密切。两者的表达水平呈相关。MMP-9及RECK基因的蛋白表达与肾细胞癌的侵袭、转移显著相关。

2.10 中耳鳞癌 Liu等［19］运用免疫组织化学的方法研究20例正常外耳道和30例中耳鳞癌患者组织中MMP-9和RECK基因的表达情况，结果表明，RECK基因在正常外耳道组织中的表达要远高于中耳鳞癌患者的癌变组织，而中耳鳞癌患者组织中的MMP-9却显示高表达，比正常外耳道组织中的表达明显要高。且发现MMP-9和RECK基因的表达与肿瘤的组织学分级及分期具有相关性。

2.11 前列腺癌 徐振宇等［20］使用蛋白质印迹和RT-PCR的方法研究前列腺癌的裸鼠模型，分为实验组和对照组，在给实验组大鼠非甾体消炎药（NS398）后，检测其 MMP-9和RECK基因的表达情况，结果显示给予NS398的实验组裸鼠，RECK基因的蛋白表达量增加明显，同时MMP-9下降，而对照组没有变化，表明NS398可通过诱导RECK基因的高表达，进而抑制MMP-9的表达而实现抑制前列腺癌的转移。

3 RECK抑制肿瘤转移的机制

3.1 RECK基因和血管生成间的关系 肿瘤需要新生血管为其提供必要的氧气和营养，才能持续性生长，进而实现侵袭和转移。肿瘤新生血管的形成由RECK基因和MMPs的相互调节所影响。当RECK基因高表达时，ECM会因MMPs受到RECK的抑制而得到保护，周围组织和血管的完整性保持不变，最终因RECK基因的高表达而抑制新生血管的形成;相反地，新生血管的形成会因RECK基因的低表达而加速形成。有实验表明，在RECK基因表达的肿瘤中血管密度降低，血管的管腔增大，血管生成受到抑制;而在无RECK基因表达的对照组中，肿瘤长大后，血管仍保持原有的密度。多位学者的研究显示，RECK基因表达水平和肿瘤组织的微血管密度之间呈负相关［21-22］。值得关注的是，此负相关性与VEGF的高表达密切相关，只有在VEGF高表达的肿瘤，RECK基因对肿瘤血管生成的作用才会明显显现，提示RECK可能是通过激活EGFR受体的方式进行功能调节［23］。

3.2 RECK基因和MMPs之间的关系 研究表明，MMPs属于水解酶的一种，能降解所有的ECM成分（糖蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖等），与肿瘤的侵袭和转移关系密切。目前已知，RECK可通过抑制MMPs而抑制肿瘤的侵袭与转移。已知3种MMPs可在转录后水平被RECK调节:MMP-9、MMP-2及MMP-14。

3.2.1 RECK与MMP-9之间的关系 RECK对MMP-9的负性调节可能通过以下两种途径:①将其酶活性直接抑制;②减少MMP-9从细胞的分泌。有实验表明，hRECKΔC蛋白与pro-MMP-9结合后，直接抑制其蛋白质水解活性。此外，突变溶解型hRECKΔC蛋白（缺少COOH的末端磷脂酰肌醇锚定区域）虽不能抑制MMP-9的释放，但将其从外部加到细胞中或转染至HT1080细胞系中后，发现其仍具有抑制浸润活性。可能首先要有膜锚定三体复合物的形成，而后RECK才能发挥抑制MMP-9的释放，从而实现抑制在细胞表面发生的MMPs活化的蛋白质水解反应。

3.2.2 RECK和MT1-MMP、MMP-2之间的关系 RECK是通过以下两个步骤来实现对MMP-2和MT1-MMP的调控［24］。首先MT1-MMP、Pro-MMP-2和基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinse，TIMP）2在细胞膜表面形成一个膜锚定的三体复合物，pro-MMP2（MMP-2的前体）的加工、处理就从此三体复合物开始。从MTl-MMP分子附近的一个特定位点，开始出现pro-MMP-2的分离，随后逐步形成MMP-2的中间体。其次，被激活后的MMP-2又可通过正反馈再次作用于MMP-2的中间体，从而进一步激活MMP-2，直至在细胞表面的MMP-2逐步成熟而释放。而RECK基因可抑制以上这两个过程，RECK通过抑制MT1-MMP来实现阻碍pro-MMP-2的活化过程，从而使活化的MMP-2的量减少，随之中间体的形成也有所减少。

3.3 RECK基因和TIMP间的关系 TIMP是存在于人体中的一种MMP抑制剂，发现有4种（TIMP 1～4），TIMP可与活化后的MMP相结合，从而终止其水解活性，同时可与MMP前酶结合，阻止其进一步的活化，进而减少ECM的降解，达到抑制肿瘤侵袭和转移的目的。Oh等［25］研究还发现，TIMP-2不仅可通过直接作用下调MMs活性，而且还可通过先调控RECK基因的表达，而达到间接调控MMP活性的目的。其中TIMP-2调控RECK的方式是通过一系列信号转导先上调Rap1，进而下调Rac1，从而实现增强RECK的表达，最终达到下调MMP活性的目的。

4 问题和展望

目前治疗肿瘤遇到的最大障碍是肿瘤的侵袭及转移。如果能在肿瘤转移之前，拥有评价肿瘤侵袭、转移的可靠指标，那将为肿瘤的治疗解决一大难题。近年来，越来越多的学者开始关注于肿瘤转移抑制基因的研究，随着分子生物学研究方法的不断进步，越来越多的转移抑制基因已被陆续发现，但很多肿瘤转移抑制基因的转移抑制还不完全明确，因此还不能用于肿瘤的诊断和治疗。RECK基因作为一种新的转移抑制基因，在许多肿瘤的发展过程中起重要作用。设想可通过药物诱导剂来提高肿瘤患者病变组织中RECK的表达量，从而达到上调肿瘤转移抑制基因的活性、抑制肿瘤浸润和转移的目的。可能在不远的将来，人们会看到依据RECK基因而设计的分子诊断和基因治疗应用于肿瘤的临床治疗。

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