真菌生物膜的研究进展

李宗辉，孔庆涛综述，桑 红审校

0 引 言

微生物在环境中大多以浮游细胞形式生长繁殖，但在复合体和浮游细胞密集的群体中，超过80%的微生物以群体整合的方式存活。这些群体是一种呈膜样生长的微生物集落，即生物膜，外表面被其自身分泌的富含多糖的细胞外多聚基质(extracellular maxtrix，ECM)覆盖，对抗菌因子有高度抵抗性［1］。由于致病真菌生物膜的形成对临床及治疗产生重大影响，因此对真菌生物膜的研究有重要意义［2-3］。近年来，研究发现多种真菌在致病过程中可形成生物膜，如白念珠菌，新生隐球菌，烟曲霉等，真菌生物膜的形成过程错综复杂，受多种调控机制的影响。现从常见人类致病真菌生物膜形成对临床的影响、生物膜的结构及形成过程中的分子机制等方面进行综述，以期为真菌生物膜的研究提供新思路。

1 真菌生物膜的形成和结构

生物膜是由细胞菌群及细胞外基质组成的复杂的有机体，它的形成与表面相关，与浮游细胞相比其拥有不同的表型［4］。生物膜的形成与营养素、菌群传感分子、表面接触等因素有关。

1.1 生物膜的形成过程 真菌生物膜形成的主要过程包括真菌细胞到达适当的位置、黏附、定植、细胞外基质的形成、生物膜的成熟和分散。

以白念珠菌为例，酵母和菌丝的形态使其形成结构复杂而密集的生物膜。生物膜的形成是连续的过程，首先酵母细胞通过细胞表面配体黏附到相关物体表面，随后微菌落形成、酵母细胞经形态转换成菌丝，迅速形成一个由菌丝缠绕的网状组织并散布芽殖的酵母细胞。随着生物膜的成熟，富含葡聚糖的ECM 逐渐积累并包裹住生物膜，从而抵抗对宿主及一些抗真菌药物的杀伤作用，并可能对生物膜的黏附起到一定的作用［5-6］。酵母细胞在周围液体如血液流动等物理压力下从生物膜形成的位点播散，黏附到新底物上，形成新的生物膜［5，7］。其他念珠菌，如热带念珠菌、近平滑念珠菌及光滑念珠菌等均能形成包含ECM 的生物膜但不产生菌丝［8］。

曲霉最初以孢子形式黏附到基底，菌丝体(菌丝形式)随生物膜的成熟而生长，随后ECM 将生物膜结合成一体。烟曲霉生物膜感染存在2 种形式:曲霉肿和曲霉病。曲霉肿感染表现为互相缠绕的菌丝球，而曲霉病感染是单独分离的菌丝［9］。

阿萨希毛孢子菌、粗球孢子菌所形成的生物膜中均包含酵母和菌丝细胞两种形式。而新生隐球菌生物膜仅含酵母细胞，及其分泌的荚膜多糖形成的ECM。虽然新生隐球菌能在交配过程中形成菌丝，但是尚未发现新生隐球菌生物膜中存在菌丝。肺孢子菌生物膜也不含菌丝结构。由此可见，真菌生物膜中菌丝形成的特点并非一致。

1.2 生物膜细胞特异性 生物膜中的细胞(固着细胞)与非黏附细胞(浮游细胞)在表现型和生理学上都存在差异。与浮游细胞相比，杀灭成熟生物膜中的固着细胞需要更高浓度的抗菌药物［10］，生物膜中脱落的细胞致病力更强［7］。生物膜的形成是治疗失败的主要原因。与生物膜的耐受力和抵抗力增加的相关机制包括抗菌因子渗透入生物膜的速度缓慢，生物膜中引起局部缓慢生长或不生长的化学微环境的改变，适应压力反应，小部分极度耐受性的存留细胞的出现［11-13］。此外，与浮游细胞相比生物膜细胞间的水平基因转移比率明显偏高［14］。

2 真菌生物膜形成的临床意义

生物膜对人类健康有重要影响，且大多影响是有害的。研究显示大于65%的人类感染与生物膜的形成相关。此外，每年超过50 万患者的死亡是由生物膜相关感染引起的［15］。随着内置导管、的广泛应用，如静脉留置管、导尿管，人工心脏瓣膜等，真菌生物膜引起的相关感染引起了人们的关注［7］。内置医疗装置，可作为一种基质使真菌定植黏附其上生长成为生物膜结构，并且在一定条件下细胞能脱离引起严重的真菌血症和/或播散感染。这些植入相关感染本身就难以解决并可能需要长期抗真菌治疗和移除植入物来控制感染。由此，真菌生物膜成为一种日益重要的临床和经济问题，了解真菌生物膜在感染中的作用将有助于临床抗感染治疗。

2.1 念珠菌 白念珠菌是一种人类黏膜表面的正常共栖菌，同时也是免疫低下患者的机会致病菌，是形成生物膜的所有病原真菌中最常见的致病菌之一。而白念珠菌是血管内导管相关感染的第三大原因，因此人们对其能形成生物膜的特性进行了深入研究［16］。在义齿口腔炎中，宿主的生物黏膜和义齿的非生物表面都存在生物膜。其他非白念珠菌种也与生物膜形成、导管相关的血液感染、器械相关感染有关，如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌等［7，17］。混合的念珠菌种生物膜也可能通过相互作用引起感染［1］。

2.2 其他酵母和丝状菌 其他酵母和丝状真菌也能引起生物膜相关感染，包括新生隐球菌、红酵母、曲霉菌、厚皮马拉色菌、毛孢子菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、芽生裂殖菌等［7］。

2.2.1 新生隐球菌 新生隐球菌是一种含荚膜的条件性致病菌，广泛存在于自然界。在免疫缺陷患者中，能引起致命的脑膜脑炎［18］。新生隐球菌可在血管分流器、腹膜透析瘘、假体髋关节、心脏瓣膜上定植并形成生物膜［7］。

2.2.2 红酵母 Nunes 等［19］对分离得到的多种红酵母进行了研究，发现红酵母也可在其相关感染过程中形成生物膜。Canabarro 等［20］从慢性牙周炎患者的龈下生物膜感染中分离出了红酵母。

2.2.3 曲霉 曲霉也能形成医学上重要的生物膜［21］。曲霉菌主要在遗传肺功能异常的患者中定植并形成生物膜，如纤维症或慢性阻塞性肺疾病［22］。曲霉可以在多种底物上形成生物膜，如导管、假体、心脏起搏器、关节置换装置、心脏瓣膜和乳房植入物等［1，23］。此外，曲霉还能在呼吸道、尿道及输尿管支架上以菌丝的球状团块形式形成曲霉肿，这也与曲霉生物膜的形成密切相关［15］。

2.2.4 厚皮马拉色菌 体外研究发现厚皮马拉色菌能在常规应用的医疗装置上形成生物膜，如聚苯乙烯平板和聚氨基甲酸乙酯导管［15］。厚皮马拉色菌是一种在健康猫狗黏液中存在的共栖酵母，但近年研究发现其已成为ICU 病房中患者真菌血症的重要病原菌，并有学者已从患病的早产儿、儿童和成人中分离出。这些感染与接受有脂质成分胃肠外营养的导管形成的生物膜直接相关［7］。

2.2.5 其他真菌 毛孢子菌是一种机会性致病真菌，不仅能在心脏移植瓣、插入的导管及乳房移植物等表面形成生物膜，引起相关感染，还能导致威胁生命的播散性感染。荚膜组织胞浆菌，是系统性真菌病组织胞浆菌病的致病菌，也能在无生命表面形成生物膜［17，24］。此外，粗球孢子菌可在脑室腹膜分流管尖端的形成生物导致复发性脑膜炎，芽生裂殖菌与导管有关的真菌血症相关。另有研究从口腔炎的义齿中分离出酿酒酵母菌［7］。

3 真菌生物膜形成的相关分子机制

近年来对于真菌生物膜在人类医学中的作用研究越来越多，对真菌生物膜形成过程中基因的表达研究也日益增多，主要包括:与生物膜形成相关的主要基因、与对抗真菌药物抵抗相关的基因以及黏附及细胞壁合成基因等方面。

3.1 真菌生物膜形成的基因决定因素 转录因子通过调节细胞表面蛋白而在调节生物膜的形成中发挥基础作用，这些细胞表面蛋白能调节菌丝形成和黏附功能［25］。BCR1 是C2H2 锌指转录因子，是白念珠菌生物膜形成的重要决定因子［26］。ACE2 也是C2H2 锌指转录因子，可通过其在白念珠菌黏附及菌丝形成中的作用而影响白念珠菌生物膜的形成［27］。白念珠菌增强菌丝生长基因(enhanced filamentous growth，EFG1)是细胞表面蛋白基因和菌丝形成的调节因子，对生物膜的至关重要［25］。在光滑念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉生物膜形成过程中特异性表达或上调的转录因子中，发现存在与BCR1、ACE2、EFG1 有相似作用的转录调节因子，这提示BCR1、ACE2、EFG1 可能是生物膜形成的保守基因［17］。Fox 等［16］鉴定出调控白念珠菌生物膜生长的转运网络，这个转运网络由EFG1、TEC1、BCR1、NDT80、ROB1 和BRG1 等主要转录因子组成。烟曲霉转录因子LAEA，主要调节细胞表型和次级代谢基因簇，在生物膜中持续高表达［28］。

细胞壁蛋白对生物膜的形成有重要作用，不仅在黏附中起作用，可能还在促进黏附诱导反应中起到传感作用［29］。在白念珠菌和烟曲霉中，许多细胞壁蛋白基因都在其生物膜形成的早期上调［30-31］。与浮游细胞相比，以生物膜形式生长的烟曲霉表面蛋白中疏水蛋白RodA、RodB、RodD、RodE 的表达增加超过4000 倍，它们在生物膜中有着极其重要的作用［29］。Gibbons 等［30］于2012 年通过对烟曲霉转录组的研究发现了10 种可能的黏附素，这些蛋白可能与白念珠菌的黏附素具有相似的作用。

3.2 真菌生物膜的基因表达 研究发现真菌生物膜细胞的基因表达与浮游细胞不同。对白念珠菌和烟曲霉生物膜形式细胞和浮游细胞基因表达谱的比较研究，揭示了生物膜形式的细胞基因表达发生重要变化［30，32］。在白念珠菌体内外生物膜中转录调节因子的特异性表达，表明生物膜的形成是受到高度调节的过程［32］。同样在烟曲霉中，与浮游细胞相比，生物膜中近50%转录因子的表达均上调，包括许多在生殖中起作用的因子。

虽然生物膜含有休眠细胞，但白念珠菌和烟曲霉的生物膜中蛋白合成基因的表达均发生了上调。这些基因编码核糖体蛋白、蛋白质转换、转录因子等，表明蛋白转录和核糖体的增加均是生物膜的特征［30-32］。在营养受限的条件下，生物膜中这些特殊基因的表达特点可使细胞组分以最优方式循环。

3.3 药物抵抗基因 在真菌体外生物膜模型研究中发现多个与药物抵抗相关的基因表达上调，如烟曲霉中的多药耐药(multi-drug resistance，MDR)基因MDR1、MDR2、MDR4 ，白念珠菌的耐药抵抗(candida drug resistance，CDR)基因CDR1、CDR2、MDR1［30］。白念珠菌MDR1 和CDR2 在体内生物膜中表达上调，尔在对氟康唑耐药的酵母细胞中不仅CDR1 和CDR2 过表达而且PDR16 也上调。在体内还存在这种时相依赖性转录因子，如白念珠菌的CDR1、烟曲霉的MDR4［31］。此外，麦角固醇基因的表达也增加了生物膜对药物的抵抗性。在白念珠菌和烟曲霉生物膜中，麦角固醇合成相关的基因表达均上调［30-31］。从患者分离的白念珠菌标本中，ERG基因表达及多种药物抵抗转录因子的增加与菌株对唑类药物抵抗性的增加一致，然而它们在成熟生物膜中的表达对唑类药物抵抗的影响仍有待研究［28］。

3.4 黏附基因 黏附基因表达的增加也是生物膜细胞的一个特性。在白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌中均存在凝集素样序列家族(agglutinin-like sequence，ALS)，其编码细胞表面黏附素糖蛋白并在生物膜形成中起重要作用［33］。在已知的黏附基因中，ALS1 在白念珠菌生物膜状态下上调最明显［34］，Garcia-Sanchez 等［32］指出ALS 基因在生物膜中特异性表达，在生物膜转录组序列中自主调控。白念珠菌ALS 家族包括8 个基因(ALS1-ALS7 和ALS9)，编码多种表面糖蛋白［34］。Nett 等［31］观察到生物膜形成的不同阶段ALS 基因的表达不同，并可能在体内有重叠的功能。在生物膜形成过程中ALS3 基因高度表达，并与白念珠菌菌丝的形成明显相关;ALS2 蛋白表达的降低会降低生物膜的菌体量，主要在生物膜生长的后期阶段起作用［33-34］。烟曲霉体外生物膜中的凝集素有相似的表达形式。以上提示生物膜黏附基因的诱导表达与基本生理过程及治疗进程密切相关。此外，白念珠菌黏附编码基因EAP1介导其向表皮细胞的黏附。EAP1 的表达受正负调控，Sir 介导的沉默使其在细胞间表现出高度的异质性。而在光滑念珠菌中，EPA6 也起到黏附功能［33］。

3.5 氨基酸合成基因 与白念珠菌浮游细胞相比，在生物膜合成过程中合成大量氨基酸，特别是硫氨基酸合成与核酸合成等基础代谢基因的表达均上调［31］。许多氨基酸是由生物膜形成所需要的转录活化因子GCN4 调节。在烟曲霉生物膜中，氨基酸透酶、转运蛋白、氨基肽酶等蛋白的代谢基因也上调。在烟曲霉生物膜中次级代谢基因上调明显，这可能与次级代谢调节因子LAEA 的上调有关［30］。

3.6 细胞壁合成基因 在诱导生物膜形成的条件下，可表达许多细胞壁合成基因。FKS1、BGL2、PHR1、XOG1 参与调节细胞外多糖的产生，在生物膜中特异性表达，对β1，3 葡聚糖的递呈和成熟、细胞外基质的积累较为重要［35］。在生长至24 h 的白念珠菌生物膜中可观察到β1，3 葡聚糖降解酶的表达下调，然而在烟曲霉中并未发现α 和β1，3 葡聚糖合成基因表达的改变［31］。菌丝体细胞外基质中α1，3 葡聚糖、胺基半乳糖、半乳甘露聚糖的出现与烟曲霉菌丝的气生生长直接相关［29］。在已发现的烟曲霉细胞壁基因中50%以上的基因在生物膜中表达改变，包括ROD 基因的上调。因此，虽然机制可能不同，但白念珠菌和烟曲霉生物膜中的细胞表面都发生了重建。

真菌生物膜的含盖面较广，其形成所涉及的调节因子能在不同的生物膜结构中保存。如白念珠菌和烟曲霉的生物膜相关基因，均能在其他形成生物膜的菌种中发现。这些表达增加的特异性生物膜相关基因，不仅包括菌丝基因，还包括转录因子和蛋白合成基因。与黏附中的基因表达不同，生物膜中细胞壁及基础代谢相关基因的表达均增加。此外，生物膜中高度耐药细胞的持续出现对整体生物膜也有着重要作用［28］。

4 结 语

近年来，随着真菌感染患者的不断增加及真菌生物膜相关感染对治疗手段的抵抗，真菌生物膜导致的感染成为一个亟需解决的临床问题。尽管人们对真菌生物膜尤其是白念珠菌生物膜的生长、特异性的生物学过程以及分子机制等进行了较为详尽的研究，但能否利用这些研究来研发新的治疗策略仍需进一步深入研究。

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