UPLC-Q Exactive 轨道阱高分辨质谱法测定小鼠血液中的NNN 及其7 种代谢物

冯明飞，刘俊辉，卢斌斌，孙世豪，洪广峰，刘帅东，张建勋

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

N-亚硝基降烟碱（NNN）是由烟草生物碱降烟碱和烟碱经亚硝化形成的烟草特有亚硝胺（TSNAs）［1］，对大鼠的食道和鼻黏膜、仓鼠的呼吸道和小鼠的肺部有致肿瘤作用［2］。NNN 的致癌性来源于体内的代谢活化，在啮齿类动物体内，其主要代谢途径是吡咯烷环的2'-和5'-羟基化，生成麦斯明、4-羟基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮［4-Hydroxy-1-（3-pyridyl）-1-butanone，HPB］、1-（3-吡啶基）-1，4-丁二醇［1-（3-Pyridyl）-1,4-butanediol，PBD］、内半缩醛、内酯等，进一步生成尿液中NNN 的主要代谢物——吡啶基丁酮酸和吡啶基羟基酸［3-4］（图1）。其他代谢途径有吡啶环N-氧化生成的NNN-N-氧化物、吡咯烷环的3'-和4'-羟基化，及生成去甲基可替宁等。

图1 NNN 在啮齿类动物体内的代谢途径

NNN 及其代谢物的检测方法主要是高效液相色谱（HPLC）法。Carmella 等［5］用优化后的HPLC系统分离了NNN 及NNK 的11 种代谢物，Hecht等［6］通过体外培养的大鼠食道研究NNN 的代谢，Upadhyaya 等［3］采用HPLC 法分析了NNN 在赤猴体内的代谢过程。HPLC-MS/MS 法较HPLC 法简单、灵敏、快速，广泛用于卷烟烟丝、烟气及动物体内TSNAs 的测定［7-10］。赵贝贝等［11］通过HPLCMS/MS 方法对家兔血液中的NNN 及其代谢物进行了测定，但关于NNN 及其7 种代谢物在小鼠血液中的研究尚未见报道。痕量分析时由于受基质背景干扰大，三重四极杆质谱在定性时准确性较低。基于高分辨率质谱可以有效降低基质干扰，且具有MS/MS 二级确证，Q Exactive 轨道阱高分辨质谱仪在痕量分析时可以较好保证定性准确［12］。因此，在赵贝贝等［11］的HPLC-MS/MS 法的基础上，通过所确立的UPLC-Q Exactive 轨道阱高分辨质谱方法，增加NNN 及其7 种代谢物的线性分析范围，分析了NNN 在小鼠血液中的变化规律，旨在为进一步研究NNN 的代谢特征提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

SPF 级C57BL/6 雌性小鼠［6～8 周，体质量18～22 g，常州卡文斯动物实验有限公司，许可证号:SCXK（苏）2011-0003］。

NNN、NNN-d4（内标）、NNN-N-氧化物、4-羟基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（HPB）、HPB-d4（内标）、麦斯明、去甲基可替宁、1-（3-吡啶基）-1，4-丁二醇（PBD）、1-（3-吡啶基）-1-丁醇-4-羧酸铵（吡啶基羟基酸铵）、1-（3-吡啶基）-1-丁酮-4-羧酸（吡啶基丁酮酸）（＞98%，加拿大TRC 公司）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）；乙腈（CP，美国J&T Baker 公司）；甲酸铵（CP，美国Tedia 公司）。

优谱佳UHPLC+高效液相色谱仪、Thermo Scientific Q Exactive 质谱仪（美 国 Thermo 公司）；BL-50A 型立式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-2F型洁净工作台、GR-70 型热空气消毒箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；Milli-Q Advantage A10 型超纯水仪（美国Millipore 公司）；KH-700DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；S25 型圆周振荡器（德国IKA 公司）；TGL18 型高速冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；CPA225D 型电子天平［感量0.000 01 g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；13 mm×0.22 μm 有机相针式滤器（上海安谱科学仪器有限公司）。

1.2 样品的处理和分析

［11,13-14］的方法，摘下注射过NNN小鼠的眼球，取血约0.5 mL，4下6 000 r/min 离心10 min；取100 μL 上清血浆，加入20 μL 20 ng/mL的NNN-d4和HPB-d4混合内标溶液以及280 μL 乙腈，涡旋30 s，超声10 min，14 000 r/min 离心10 min；取上清液，用针式滤器过滤，取样分析。分析条件为:

色谱柱及柱温条件和流动相A 同文献［11］；进样量:10 μL；流速:0.3 mL/min；流动相B:乙腈；洗脱梯度:5%A 于2 min 内线性升至15%，2～7 min线性升至25%，于0.5 min 内线性降至5%，维持7.5 min。

离子源:加热型电喷雾（HESI）；离子源温度:300；正离子模式下电喷雾电压:3.5 kV；鞘气:206.85 kPa；辅助气流速:3.33 L/min；传输毛细管温度:320；扫描模式:FS/ddMS2［12］，一级全扫描（分辨率R=70 000，扫描质量范围100～500 amu），二级扫描分辨率R=17 500。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

NNN 及其代谢物的极性较强，参照文献［11］中的色谱条件，选择HILIC 色谱柱。按文献［11］的洗脱梯度及降低流速（0.3 mL/min）后均不能将化合物完全分离。实验中调整了流动相的洗脱梯度，调整后8 种化合物的分离效果良好（图2）。

所选内标NNN-d4和HPB-d4均为分析物的同系物，选择的原则是低浓度时内标的峰形良好，基质干扰少，低浓度时灵敏度低。

图2 NNN 及其代谢物的分离色谱图

2.2 质谱条件的选择

由于Q Exactive 质谱仪具有高分辨率，一级全扫描时通过各分析物的母离子可以进行定量分析。通过MS/MS 二级扫描确认各分析物的碎片离子，可对化合物进行更为准确的定性。图3 显示的是NNN 的质量浓度为2、20、100 ng/mL 时有全扫描数据依赖触发MS/MS 二级扫描的结果。质荷比（m/z）为148.099 6，120.068 5 的两个峰表示NNN 的两个碎片离子，二级扫描通过确认其是否存在可进一步定性确证。各分析物的质子化离子质量及相对丰度较大的碎片离子质量如表1 所示。

图3 不同浓度下NNN 的二级碎片离子扫描结果

2.3 工作曲线和检出限

各标准品分别用甲醇溶解，用乙腈定容，分别得100 μg/mL 的储备液，-40保存。采用经处理的空白血浆配制系列标准工作溶液。NNN 的浓度梯度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 ng/mL，其余分析物的对应浓度梯度为0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00、250.00、500.00 ng/mL，两种内标的浓度均为1 ng/mL。采用内标法定量，NNN 的内标为NNN-d4，其余分析物的内标为HPB-d4。以各分析物的色谱峰面积与内标峰面积之比为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X）进行线性回归分析，得标准曲线回归方程及相关系数（R2）。将各标样的最低浓度设10 次重复，计算标准偏差，分别以3 倍和10 倍标准偏差为方法得到检出限和定量限，见表2。可知，各分析物的回归方程线性良好，定量限为0.064～0.225 ng/mL。与赵贝贝等［11］的HPLC-MS/MS 方法相比，本方法中工作曲线的最低浓度降低了一个数量级，定量限较低，说明UPLC-Q Exactive 轨道阱高分辨质谱法更适合于复杂样品中痕量分析物的检测。

表1 各分析物的质子化离子质量及碎片离子

2.4 重复性和回收率

将分析物的标准溶液加入空白血浆中，制备5种不同浓度的质控样品，NNN 的浓度分别为0.5、2.0、20.0、100.0 和500.0 ng/mL，其他分析物的浓度均为0.25、1.00、10.00、50.00 和250.00 ng/mL，内标的浓度为1 ng/mL。5 种浓度的质控样品分别取6份进行日内分析，回收率和精密度结果（表3）表明，5 个浓度水平样品的精密度在0.47%～8.38%之间，低于赵贝贝等［11］的HPLC-MS/MS 方法的精密度；回收率为78.0%～117.5%。

表2 各分析物的工作曲线回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 小鼠血液中NNN 随时间的代谢

50 只小鼠随机分为10 个小组，每个小组5 只，每个小组对应一个时间点。小鼠空腹12 h 后腹腔注射NNN（6.64 mg/kg 体质量，溶于生理盐水）。NNN 注射5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min后，分别摘眼球，取血，随后进行样品处理与分析。以NNN 及其代谢物的质量浓度为纵坐标，时间为横坐标作图（图4）。

由图4 可知，NNN 的浓度在30 min 内迅速下降，说明NNN 在体内代谢很快。注射NNN 后，短时间内代谢物均已产生，并且随时间的延长，大部分代谢物的浓度呈下降趋势；各分析物浓度在约90 min 后趋于稳定。对各分析物的血药浓度-时间曲线下面积（AUC）比较可知，在NNN 的所有代谢物中，吡啶基羟基酸在血液中的总量最大。这与家兔血液中的研究结果［11］一致，其次是去甲基可替宁和吡啶基丁酮酸。由图1 可知，吡啶基羟基酸来源于NNN 的5'-羟基化，吡啶基丁酮酸主要来源于NNN 的2'-羟基化。这说明NNN 的5'-羟基化可能是小鼠血液中的主要代谢途径。

表3 不同浓度下各分析物的精密度和回收率（n=6）

图4 小鼠血液中NNN 及其代谢物浓度随时间的变化

3 结论

①建立了一种同时检测小鼠血液中NNN 及其7 种代谢物的UPLC-Q Exactive 轨道阱高分辨质谱法。②NNN 及其代谢物的检出限为0.019～0.067 ng/mL，日内精密度为0.47%～8.38%，回收率在78.0%～117.5%之间；该方法检出限低、灵敏度高，适合于小鼠血浆中NNN 及其代谢物的检测。

参考文献

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