盐度渐变与骤变对脊尾白虾渗透、代谢及免疫相关酶活力的影响

李玉全，李永生，赵法箴

1 青岛农业大学海洋科学与工程学院， 青岛 266109 2 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛 266071

盐度渐变与骤变对脊尾白虾渗透、代谢及免疫相关酶活力的影响

李玉全1，*，李永生1，赵法箴2

1 青岛农业大学海洋科学与工程学院， 青岛 266109 2 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 青岛 266071

为探讨盐度变化对脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)渗透、代谢及免疫相关酶活力的影响，实验设置了盐度渐变和骤变两个实验。渐变实验，设置5、10、15、20、25、30、33(CK)、40 和45 共9个盐度梯度；骤变实验，盐度从33突变至0、5、15、25 和 45，检测血清ATP酶(包括Na+/K+-ATP酶和总ATP酶)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果表明，渐变情况下，盐度为5时，ATP酶活力出现最高值，然后随着盐度的升高表现出先降低后升高的趋势。总ATP酶活力在盐度为15—30之间较稳定，并在此范围内达到最低值。AKP和ACP活力几乎不受盐度渐变的影响。SOD活力随盐度的升高，先上升后下降，并在盐度为33时达到最大值。骤变情况下，ATP酶活力随时间波动较大，AKP和SOD随时间波动较小，而ACP几乎不受影响。结果说明，盐度骤变对脊尾白虾酶活力的影响较盐度渐变明显，ATPase和SOD活力更易随盐度而变化，代谢酶(AKP、ACP)受盐度变化的影响较小，说明渗透调节和免疫相关酶活力对盐度变化反应敏感，养殖过程中应尽量保持盐度稳定。

脊尾白虾;盐度;酶活力

脊尾白虾(ExopalaemonCarinicauda)是我国特有的重要经济虾类，广泛分布于我国河口、浅海及近海区，以渤海和黄海海区分布最为广泛。该虾是我国传统渔业物种，除直接销售外，还可加工成虾仁，被誉为“金钩虾米”，其卵还可制作成虾子酱，是深受人们喜爱的美食。近年来对其生物学特性、繁育、养殖等各方面的研究日趋增多[1- 2]。

脊尾白虾盐度适应范围很广，可适应4—35变幅，最适盐度22—28[11- 12]，驯化后甚至可以在纯淡水中生长和繁殖[13]。虾体生活在盐度为4.5—35.5的海水(渗透压114—1178 mOsm/kg)中，其血淋巴渗透压587—797 mOsm/kg[14]，即当外界环境的渗透压发生大幅变化时，机体血淋巴的渗透压较为稳定。这说明，在半咸水条件下，脊尾白虾可能采取高渗调节的方式维持渗压平衡，而在真盐水中则可能采取低渗调节维持渗压平衡。无论是低渗调节和还是高渗调节都是伴随水体盐度变化而产生的，即在外界盐度发生变化时脊尾白虾机体会产生一系列调节适应，其中酶活力是重要的调节方式之一。然而，目前盐度变化对脊尾白虾相关酶活力的影响未见相关报道。本文拟探讨盐度渐变和骤变对脊尾白虾相关酶的影响，实验结果将有助于了解脊尾白虾渗透、代谢以及免疫等调节的机理，从而为脊尾白虾增养殖及资源保护提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验于青岛农业大学海洋科学与工程学院水循环实验室进行，所用脊尾白虾购自青岛市城阳水产零售市场，为胶州湾野生群体，原初水体盐度31。选择体色透明、健康活跃、无外伤、规格一致者作为实验材料，实验前暂养7 d。

1.2 实验方法

实验分盐度渐变和骤变两组进行。以自然海水为基础，盐度33、pH值8.3±0.2，水温控制在(15±0.5)℃，用曝气24 h的自来水和粗盐调配实验所需的低盐或高盐水。

1.2.1 渐变实验

渐变实验共设置9个盐度梯度，分别为5、10、15、20、25、30、33、40和45。其中33为自然海水的盐度。实验中脊尾白虾分为两组，一组进行升盐处理，每天升5个盐度，升到盐度分别为40或45时适应24 h，并随机取45尾，放到对应盐度的处理中进行实验。另一组进行降盐处理，盐度降为15之前每天降5个盐度，并在盐度降为30、25、20、15时分别适应24 h，并随机取45尾分别放入对应盐度的处理中进行实验。盐度降为15后，每2d降5个盐度，并在盐度降为10、5时分别适应24 h，并随机取45尾分别放入对应盐度的处理中进行实验。每天的盐度升降分2次进行，采样逐渐换水的方式，时间间隔为10—12 h。各盐度梯度下养殖2周，随机取虾抽取血淋巴混合约1.0 mL置于1.5 mL 离心管中，4 ℃冰箱中过夜，5000 r/min离心10 min，取上清液放入-20 ℃冰箱中保存以备酶活测定用。

1.2.2 骤变实验

骤变实验共设置5个盐度梯度，分别为0、5、15、25和45。从盐度为33的暂养桶中分别随机取45尾脊尾白虾，放入对应盐度的处理中进行实验，并分别于放入虾后1、6、12、18、24、36 h和48 h时随机取5尾左右脊尾白虾抽取血淋巴混合，4 ℃冰箱中过夜，5000 r/min离心10 min，取上清液放入-20 ℃冰箱中保存以备酶活测定用。

1.3 酶活力的测定

本实验共测定4种相关酶的活力：ATPase(包括Na+/K+-ATPase和总ATPase(T-ATPase))、AKP、ACP和SOD。酶活力测定采用南京建成科技有限公司生产的相应酶试剂盒，按说明书描述的步骤进行。

1.4 数据处理与统计分析

实验数据借助SPSS 13.0进行统计分析，利用单因素方差分析和LSD检验法统计分析差异性。借助EXCEL 2003进行作图，所有数据用3个平行组数据的平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 盐度变化对ATPase活力的影响

由图1可知，盐度渐变对Na+/K+-ATPase和T-ATPase活力具有极显著影响(P<0.01)。其中，盐度从10渐变到5时，Na+/K+-ATPase活力升高了65%，T-ATPase活力升高了62%。这有可能说明Na+/K+-ATPase和T-ATPase在脊尾白虾由低渗调节转变为高渗调节时发挥重要作用。Na+/K+-ATPase活力在盐度为10到45之间没有显著变化(P>0.05)，T-ATPase活力在10到33之间和40到45之间没有显著变化(P>0.05)，33到40之间上升了63%。Na+/K+-ATPase和T-ATPase活力随盐度变化的总体趋势是先大幅度下降，盐度为10到33之间相对平稳，盐度大于30后又有所上升。

图1 盐度渐变对脊尾白虾ATP(Adenosine triphosphate)酶活力的影响Fig.1 Effects of salinity gradient on ATPase activity of E. carinicauda 不同字母表示处理间差异显著(P <0.05)

盐度骤变实验中，盐度骤变为0处理的脊尾白虾在1 h左右全部死亡；骤变为5处理的脊尾白虾在 4—5 h内全部死亡；骤变为45处理的脊尾白虾从17 h到48 h之间死亡较多。由图2可知，盐度从33骤变到45过程中，Na+/K+-ATPase和T-ATPase都具有极显著的变化(P <0.01)。总体来看，Na+/K+-ATPase活力出现双峰曲线变化，峰值分别出现在骤变后6h和36h，其中36h时出现最高值；T-ATPase活表现为单峰曲线变化，峰值出现在盐度骤变后36h。

图2 盐度骤变对脊尾白虾ATP酶活力的影响Fig.2 Effects of salinity abrupt on ATPase activity of E. carinicauda

2.2 盐度变化对AKP活力的影响

由图3可知，AKP活力受盐度渐变的影响不显著(P >0.05)，但随着盐度升高，AKP活力有升高的趋势。而盐度从33渐变到30或从33渐变到40时，AKP活力均有显著变化(P<0.05)。

由图4可知，盐度骤变到25或45时，AKP活力变化极显著(P<0.01)；骤变到25时AKP活力随时间变化呈现出先上下波动后上升的趋势；骤变到45时，AKP活力呈现先下降后上升的趋势。

2.3 盐度变化对ACP活力的影响

由图5可知，渐变实验中，ACP活力受海水盐度变化的影响不显著(P>0.05)。

由图6可知，盐度骤变到25或者45均对ACP活力有极显著的影响(P<0.05)。总体来看，盐度骤变到45时，随着时间的变化，ACP活力呈先下降后上升的趋势，并渐趋于稳定；骤变到25时，ACP活力则呈下降趋势；骤变到15时，ACP活力略高于自然海水(33)，差异不显著(P >0.05)。

图3 盐度渐变对脊尾白虾碱性磷酸酶(AKP)活力的影响Fig.3 Effects of salinity gradient on AKP activity of E. carinicauda

图4 盐度骤变对脊尾白虾AKP活力的影响Fig.4 Effects of salinity abrupt on AKP activity of E. carinicauda

图5 盐度渐变对脊尾白虾酸性磷酸酶(ACP)活力的影响Fig.5 Effects of salinity gradient on ACP activity of E. carinicauda

图6 盐度骤变对脊尾白虾ACP活力的影响Fig.6 Effects of salinity abrupt on ACP activity of E. carinicauda

图7 盐度渐变对脊尾白虾SOD活力的影响Fig.7 Effects of salinity gradient on SOD activity of E. carinicauda

2.4 盐度变化对SOD活力的影响

由图7可知，SOD酶活力随着盐度的变化总体具有上升的趋势，盐度为33时出现最大值，但盐度渐变对SOD酶活力的影响未达到显著水平(P>0.05)。

由图8可知，盐度骤变到25或45时，SOD活力变化极显著(P<0.01)。总体来看，骤变到25时，SOD活力先上升，达到渐变到该盐度时的SOD活力水平时稳定下来；骤变到45时，SOD活力在24h内呈剧烈波动状态，后趋于稳定。

图8 盐度骤变对脊尾白虾SOD活力的影响 Fig.8 Effects of salinity abrupt on SOD activity of E. carinicauda

3 讨论

3.1 盐度变化对脊尾白虾渗透相关酶的影响

水生生物在长期的进化过程中，已经逐渐适应外界环境中的盐度变化。它们主要通过调控血淋巴的渗透压维持内液的稳态，以保证机体正常的生命活动[15]。机体血淋巴中的钠离子和氯离子是形成渗透压的主要因子[16]，离子调控主要靠鳃上皮细胞膜上的离子转运酶来实现，其中Na+/K+-ATPase是维持机体Na+、K+离子平衡的关键酶[17]。当盐度发生变化时，Na+、K+离子渗透压发生变化，为维持Na+、K+离子的平衡，机体需要Na+/K+-ATP来协助调节机体内部的Na+、K+离子浓度，并且，在高盐和低盐环境下，维持Na+、K+离子平衡所付出的Na+/K+-ATP会增加，因此，Na+/K+-ATPase活力会提高。本实验还发现，盐度在10—45范围内时，Na+/K+-ATPase活力变化不显著，说明此盐度范围内脊尾白虾可以快速调节维持Na+、K+离子的平衡，而当盐度低于10时，机体需付出大量的Na+/K+-ATP来维持平衡。而当盐度骤变时，Na+/K+-ATPase活力会发生大幅度的波动，可能与机体的应激反应难以适应短时间大幅度的渗透压变化有关。结合实验过程中脊尾白虾的成活率，发现当盐度渐变降至10以下或升至40以上时会显著降低其成活率，说明过高或过低盐度脊尾白虾短时间内很难适应。因此，在进行脊尾白虾淡化养殖或高盐养殖时当盐度降至10或升至40时应放慢驯化速度，使其充分适应后再进行下一步盐度驯化，具体驯化措施还需进一步探讨。

另外，盐度的变化还会引起活性氧分子大量生成，从而产生与之有关的应激反应[4]。这一过程会造成组织的氧化损伤以及机体的渗透失衡。机体需要消耗大量的ATP进行调节。当盐度变化幅度过大时，机体调节平衡所消耗的ATP就会增多，当盐度的变化超出机体自身的耐受范围时，这种平衡往往会被打破[18]。本实验证明，盐度的渐变和骤变都会对脊尾白虾的总ATPase活力产生极显著的的影响，盐度的骤变会使总ATPase活力大幅度波动，这可能是盐度骤变导致ATP的异常消耗，这与前人的观点一致[19]。

3.2 盐度变化对脊尾白虾代谢相关酶的影响

AKP和ACP在蛋白(酶)的去磷酸化过程中起着十分重要的作用。它们不仅参与一些营养物质的消化、吸收、运输，而且还是生物体内重要的解毒体系[4]。因此，通过探讨盐度变对AKP和ACP活性的影响，有助于了解盐度对机体的营养物质消化、吸收、运输以及生物体内抗氧化系统的影响。王维娜等分析了盐度等环境因子对日本沼虾消化酶和碱性磷酸酶的影响[20]，刘存歧等分析了金属离子对中国对虾幼体体内碱性磷酸酶和ATPase的影响[21]，发现外界环境因子变化会影响磷酸酶的活力，认为磷酸酶活力的高低可作为判别环境因素是否适合对虾生存的指标。本实验证明，盐度渐变对AKP和ACP活力均未产生显著影响，但盐度在30—40范围内AKP活力产生显著波动；盐度骤变对AKP和ACP活力均产生了显著影响。由此推断，盐度渐变对脊尾白虾磷代谢相关酶活力影响较小，不会显著影响机体的磷代谢，但盐度骤变可能会对脊尾白虾的磷代谢产生显著影响。这与季延滨等在凡纳滨对虾上的研究结果相一致[22]。

3.3 盐度变化对脊尾白虾免疫相关酶的影响

有研究发现血液中SOD活性更为敏感，能更迅速的反应出环境中有害物质对机体的毒性作用[23]。本实验发现，盐度渐变，SOD活力变化活跃。当盐度在20到33的范围内时，SOD活力维持在较高水平，盐度为33时出现最大值。换言之，盐度的升高或者降低都会对SOD活力产生负面影响。因此，盐度在20到33范围内时，脊尾白虾具有相对较高的免疫抵抗能力，盐度过低或者过高都会影响其免疫活力。而盐度骤变实验表明，当盐度发生骤变时，脊尾白虾SOD活力都会在短时间内降低。随着时间的增长，又会逐渐恢复到对应盐度的水平。由此可知，盐度发生骤变时会短时间内降低机体的免疫力，从而增大患病的几率。这与前人在凡纳滨对虾上的研究结果相一致[22]。因此，养殖过程中维持盐度的相对稳定是非常重要的。

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Effect of salinity changes on osmotic-, metabolic-, and immune-related enzyme activities inExopalaemoncarinicauda

LI Yuquan1，*, LI Yongsheng1, ZHAO Fazhen2

1CollegeofMarineScience&Engineering,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China

2KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture,YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071,China

Exopalaemoncarinicaudais an economically important shrimp species that is naturally distributed in the estuaries and coastal areas of China, especially in the Yellow Sea and the Bohai Sea, and contributes to one-third of the gross output of polyculture ponds in eastern China. Despite its economic importance, basic biological knowledge about this species remains limited. Salinity is one of the most important and changeable water quality factors affecting the physiology of aquatic organisms. Salinity variation may cause a variety of physiological responses, such as plasma enhanced stress-related hormones, stimulation of energy metabolism, and disruption of electrolyte equilibrium. Consequently, marine organisms have developed various survival mechanisms against salinity variation. For example, crustaceans adjust osmolarity and maintain an intra-corporal stable state by varying related enzyme activities.E.carinicaudalive in estuaries and coastal areas with highly variable salinity; yet, little is known about the osmotic adjustment mechanisms of this species. Enzyme activity regulation is one of the most important osmotic adjustment mechanisms. To investigate the effects of acute and gradual salinity changes on enzyme the enzyme activity ofE.carinicauda, two different experiments (acute change and gradual change) were performed. In the gradual change experiment, we used two different treatments. In the first treatment, the salinity was gradually raised from 33 to 40 and 45. In the second treatment, the salinity was gradually reduced from 33 to 5, 10, 15, 20, 25, and 30. For each salinity level, a group of 45 animals were randomly selected and cultured for two weeks. In the acute change experiment, five groups of 45 animals were randomly selected at 33 salinity, which was then abruptly changed to 0, 5, 15, 25, and 45. In each group, blood was collected from the animals for further enzyme activity analysis. ATPase (Na+/K+-ATPase and total ATPase), alkaline phosphatase (AKP), acidic phosphatase (ACP), and superoxide dismutase (SOD) activity was detected. In the gradual change experiment, maximum ATPase activity occurred at salinity 5. Interestingly, at the start of increasing salinity, ATPase activity rapidly decreased, but then increased with increasing salinity. Total ATPase activity was more stable in the range of salinity changes between 15 and 30, and reached a minimum level within this range. However, AKP and ACP activity was not significantly affected by gradual salinity changes. SOD activity initially increased, but then decreased with increasing salinity, with the maximum being detected at salinity 33. In the acute salinity changes experiment, ATPase activity fluctuated more intensely than AKP and SOD activity, while ACP activity was minimally affected. The results indicate that the effects of acute change on related enzyme activity were greater than those obtained through gradual change. ATPase and SOD activity was more vulnerable to salinity change than AKP and ACP activity. Overall, osmotic adjustment and immune related enzyme activity are very sensitive to salinity changes. These results are expected to help improve our understanding about the mechanisms of osmotic, metabolic, and immune regulation ofE.carinicaudaresponses to salinity changes. Which are expected to set a foundation for future breeding and resource protection for this species.

Exopalaemoncarinicauda; salinity; enzyme activity

国家自然科学基金项目(31101916)；山东省现代农业产业技术体系虾蟹类创新团队(SDAIT-15-011)；山东省自然科学基金项目(ZR2010CM060)；青岛市科技成果转化引导计划(14-2-4-87-jch)

2014- 02- 10;

日期:2015- 04- 14

10.5846/stxb201402100226

*通讯作者Corresponding author.E-mail: jiangfangqian@163.com

李玉全，李永生，赵法箴.盐度渐变与骤变对脊尾白虾渗透、代谢及免疫相关酶活力的影响.生态学报,2015,35(21):7229- 7235.

Li Y Q, Li Y S, Zhao F Z.Effect of salinity changes on osmotic-, metabolic-, and immune-related enzyme activities inExopalaemoncarinicauda.Acta Ecologica Sinica,2015,35(21):7229- 7235.