新型含吡唑的噻唑并［3，2-a］嘧啶类化合物的合成及其抗肿瘤活性*

王　京，林　娅，朱心玲，聂　晶，张　磊，姚其正(．遵义医学院药学院，贵州遵义　563003; ．中国药科大学药学院，江苏南京　0009)

新型含吡唑的噻唑并［3，2-a］嘧啶类化合物的合成及其抗肿瘤活性*

王京1，林娅1，朱心玲1，聂晶1，张磊1，姚其正2
(1．遵义医学院药学院，贵州遵义563003; 2．中国药科大学药学院，江苏南京210009)

摘要:以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮为原料，经Vilsmeier－Haack反应和Biginelli反应制得4-(5-氯-3-甲基-1-苯基-唑-4-基) -5-甲酸乙酯-6-甲基-3，4-二氢嘧啶-2(1H) -硫酮(3) ; 3与芳醛经Knoevenagel反应合成了5个新型的含吡唑的噻唑［3，2-a］并嘧啶类化合物(5a～5e)，其结构经1H NMR，13C NMR，IR和ESI-MS表征。采用MTT法测定了5a～5e的抗肿瘤活性。结果表明: 5a～5e对人前列腺癌PC-3细胞均具有一定的体外抗增殖活性，其中2-【4-{［6-(乙氧羰酯) -5-(5-氯-3-甲基-1-苯基-吡唑-4-基) -3-氧代-7-甲基-噻唑并［3，2-a］嘧啶-2(5H) -亚基］甲基}苯氧基】乙酸(5a)活性最强，其IC50为44．45 μM。

关键词:噻唑并［3，2-a］嘧啶;吡唑;合成;抗肿瘤活性

噻唑并［3，2-a］嘧啶是一类具有多种生物活性的母核结构，如抗病毒［1］、抗肿瘤［2］、抗炎［3］和抗菌［4］等，同时还能抑制Bcl-2家族抗凋亡亚族蛋白［5］及CDC25B磷酸酯酶［6］。吡唑作为一类结构特殊的氮杂环，也具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗菌和抗炎等。近年来，上述两类化合物受到了人们广泛的关注和研究。因此，将具有抗肿瘤活性的噻唑并［3，2-a］嘧啶结构和吡唑结构融合到一个新型分子中，对筛选具有抗肿瘤活性的先导化合物具有重要的意义。

为此，本文以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(1)为原料，经Vilsmeier－Haack反应和Biginelli反应制得4-(5-氯-3-甲基-1-苯基-唑-4-基) -5-甲酸乙酯-6-甲基-3，4-二氢嘧啶-2 (1H) -硫酮(3) ; 3与芳醛(4a～4e)经Knoevenagel反应合成了5个新型含吡唑的噻唑［3，2-a］并嘧啶类化合物(5a～5e，Scheme 1)，其结构经1H NMR，13C NMR，IR和ESI-MS表征。采用MTT法测定了5a～5e对人前列腺癌PC-3细胞的体外抗肿瘤活性。

Scheme 1

1　实验部分

1．1仪器与试剂

Mel-TEMP型熔点仪(温度未校正) ; Bruke Avance 300 MHz型和Agilent-NMR-vnmrs 400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标) ; Nicolet Impact 410型红外光谱仪(KBr压片) ; Agilent 1100 LC/DAD/ MSD型质谱仪。

5-氯-3-甲基-1-苯基-4-吡唑甲醛(2)［10］和3［11］参考文献方法合成;薄层层析板和硅胶，青岛海洋化工厂;其余所用试剂均为分析纯。

1．2 5a～5e的合成(以5a为例)

在反应瓶中加入混合溶剂［V(醋酸)∶V(醋酸酐) = 4∶3］7 mL，搅拌下依次加入3 0．78 g(2 mmol)，2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸(4a) 0．36 g(2 mmol)，氯乙酸0．20 g(2．2 mmol)和乙酸钠0．16 g (2 mmol)，回流反应6 h(TLC检测)。冷却至室温，倾入冰水混合物中，搅拌析晶;抽滤，滤饼用水(3×5 mL)洗涤，干燥后用甲醇重结晶得黄色固体2-【4-{［6-(乙氧羰酯) -5-(5-氯-3-甲基-1-苯基-吡唑-4-基) -3-氧代-7-甲基-噻唑并［3，2-a］嘧啶-2 (5H) -亚基］甲基}苯氧基】乙酸(5a)。

用类似的方法合成黄色固体5b～5e。

5a:收率79%，m．p．152℃～154℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．29(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，4．06～4．13(m，2H，CH2in Et)，4．91(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．10 (d，J = 8．5 Hz，2H，ArH)，7．44～7．58(m，7H，ArH)，7．79(s，1H，CH =) ;13C NMR δ: 12．74，14．50，22．89，46．93，60．64，65．07，105．58，116．00，117．00，117．19，117．52，125．25，126．22，126．48，126．61，128．85，129．67，132．52，133．21，137．89，148．94，152．12，155．87，159．91，160．18，164．89，165．41，169．24，170．18; IR ν: 3 746，3 604，3 392，3 191，2 979，2 931，1 770，1 714，1 593，1 552，1 502，1 413，1 363，1 322，1 216，1 148，1124，1074，998 cm－1; ESI-MS m/z: 591．3{［M－H］－}。

5b:收率62%，m．p．143℃～146℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．29(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，3．83(s，3H，OCH3)，4．06～4．17(m，2H，CH2in Et)，4．78(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．01(d，J =8．4 Hz，1H，ArH)，7．15～7．20 (m，2H，ArH)，7．42～7．54(m，5H，ArH)，7．78(s，1H，CH =) ;13C NMR δ: 12．71，14．47，22．89，46．90，56．07，60．63，65．31，105．51，113．69，114．00，117．21，117．53，124．03，125．21，126．57，128．81，129．64，133．63，137．90，148．96，149．48，149．91，152．18，155．84，164．80，165．37，170．13; IR ν: 3 634，3 185，2 979，2 932，2 713，2 330，1 707，1 619，1 593，1 555，1 512，1 422，1 368，1 327，1 396，1 277，1 231，1 158，1121，1057 cm－1; ESIMS m/z: 623．1{［M +H］+}。

5c:收率67%，m．p．198℃～200℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，1．36(t，J =6．9 Hz，3H，CH3in Et)，2．29(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，4．06～4．17(m，4H，CH2in Et)，4．91(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．02(t，J =8．5 Hz，1H，ArH)，7．13～7．21 (m，2H，ArH)，7．41～7．54(m，5H，ArH)，7．77 (s，1H，CH =) ;13C NMR δ: 12．73，14．48，15．02，22．79，46．88，52．35，60．66，64．41，65．30，105．49，114．03，114．95，117．23，117．46，123．95，125．24，126．59，126．75，128．85，129．67，133．73，137．85，148．64，148．93，149．77，151．99，156．00，164．77，165．34，169．33，170．22; IR ν: 3 480，2 979，2 914，2 855，2 377，1 761，1 731，1 708，1 661，1 590，1 552，1 502，1 419，1 369，1 307，1 281，1 162，1 142，1 121，1 065，1 001 cm－1; ESI-MS m/z: 635．1{［M－H］－}。

5d:收率70%，m．p．205℃～207℃;1H NMR δ: 1．21(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．23(s，3H，CH3)，2．43(s，3H，CH3)，4．12～4．23(m，2H，CH2in Et)，4．80(s，2H，a-H)，6．15(s，1H，CH)，7．10～7．27(m，3H，ArH)，7．49～7．60(m，6H，ArH)，7．87(s，1H，CH = ) ;13C NMR δ: 12．74，14．50，22．86，46．97，60．70，64．94，105．83，115．90，117．31，117．58，120．48，123．03，125．27，126．65，128．87，129．67，130．98，133．12，134．64，137．85，148．93，151．92，155．59，158．61，164．68，165．37，170．43; IR ν: 3 474，3 415，3 191，2 949，2 525，2 289，1 746，1 708，1 609，1 540，1 499，1 372，1 326，1 303，1 261，1 222，1 161，1 074 cm－1; ESI-MS m/z: 591．0{［M－H］－}。

5e:收率72%，m．p．165℃～167℃;1H NMR δ: 1．15(t，J =7．0 Hz，3H，CH3in Et)，2．30(s，3H，CH3)，2．37(s，3H，CH3)，4．06～4．17(m，2H，CH2in Et)，4．98(s，2H，a-H)，6．08(s，1H，CH)，7．08～7．18(m，2H，ArH)，7．44～7．54(m，7H，ArH)，8．06(s，1H，CH = ) ;13C NMR δ: 12．74，14．47，22．64，46．96，52．41，60．70，65．32，105．66，113．41，117．27，120．15，122．07，122．29，125．23，126．65，128．11，128．82，129．26，129．64，133．04，137．85，148．95，151．61，156．18，156．87，164．80，165．29，169．23; IR ν: 3 463，3 168，2 985，2 920，2 855，2 330，2 123，1 935，1 742，1 704，1 591，1 548，1 499，1 448，1 360，1 309，1 277，1 227，1 161，1 048 cm－1; ESI-MS m/z: 591．4{［M－H］－}。

1．3体外抗肿瘤活性测试

以5-氟脲嘧啶(5-FU)为阳性对照，采用四氮唑盐还原法(MTT法)测定5a～5e对人前列腺癌PC-3细胞(简称PC-3)的体外抗肿瘤活性。

将处于指数生长期的细胞配成c为3．5×104个·mL－1的细胞悬液，在96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液(每孔3．5×103个细胞)，将细胞培养板置于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100 μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组，96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养72 h。每孔加入20 μL MTT(5 mg· mL－1)，在培养箱继续培养4 h。弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO溶解，混匀10 min，于酶标仪读出每孔的OD值(λ=490 nm)，计算抑制率，再由统计软件SPSS17．0计算出半数抑制浓度(IC50)值。

2　结果与讨论

2．1抗肿瘤活性

5a～5e的体外抗增殖活性结果见表1。由表1所示，5a～5e对PC-3均具有一定的体外抗肿瘤活性，其中5a的活性最强，其IC50值为44．45 μM，与5-FU(38．47 μM)相当; 5c和5e对PC-3没有显示出抑制肿瘤细胞增殖的作用，其IC50值均大于100 μM。

在倒置相差显微镜下进一步观察不同c(5a)作用于PC-3细胞72 h后其细胞数量及形态的变化，结果见图1。

图1　　c(5a)对PC-3细胞形态的影响(作用时间72 h)Figure 1 　Effect of c(5a) on morphology of PC-3 cells for 72 h

表1　　5a～5e对人前列腺癌PC-3细胞的体外抗增殖活性Table 1 　Anticancer activities of 5a～5e against PC-3 cells in vitro

由图1可见，阴性对照组细胞数量较多，其轮廓清晰且活力旺盛;而实验组细胞数量随着c(5a)增大而显著减少，且细胞皱缩、变形和染色质浓缩。

2．2构效关系

初步构效关系研究表明:结构末端的氧代乙酸片段处于苯环对位(5a)时，化合物的抗肿瘤活性较强;处于间位(5d)的次之，处于邻位(5e)没有活性;当氧代乙酸片段处于苯环对位，而相邻位置有取代基时，化合物的活性减低，并且取代基越大，活性越低，如5b和5c。

3　结论

利用药效团骨架拼合等原理，设计并合成了5个新型含吡唑的噻唑并［3，2-a］嘧啶类化合物(5a～5e)。同时采用MTT法测试了其对人前列腺癌PC-3细胞的细胞毒性。结果表明: 5a～5e均具有一定的抗肿瘤细胞增殖活性，其中5a的抗肿瘤活性最强，与阳性对照5-FU药效相当，具有进一步深入研究的价值。

参考文献

［1］Mohamed S F，Flefel E M，Amr A E G E，et al．Anti-HSV-1 activity and mechanism of action of some new synthesized substituted pyrimidine，thiopyrimidine and thiazolopyrimidine derivatives［J］．Eur J Med Chem，2010，45(4) :1494－1501．

［2］Holla B S，Rao B S，Sarojini B K，et al．One pot synthesis of thiazolodihydropyrimidinones and evaluation of their anticancer activity［J］．Eur J Med Chem，2004，39 (9) :777－783．

［3］Hu J，Wang Y，Wei X，et al．Synthesis and biological evaluation of novel thiazolidinone derivatives as potential anti-inflammatory agents［J］．Eur J Med Chem，2013，64:292－301．

［4］Pan B，Huang R，Zheng L，et al．Thiazolidione derivatives as novel antibiofilm agents: Design，synthesis，biological evaluation，and structure-activity relationships ［J］．Eur J Med Chem，2011，46(3) :819－824．

［5］Zhou B，Li X，Li Y，et al．Discovery and development of thiazolo［3，2-a］pyrimidinone derivatives as general inhibitors of Bcl-2 family proteins［J］．Chem Med Chem，2011，6(5) :904－921．

［6］Kolb S，Mondésert O，Goddard M L，et al．Development of novel thiazolopyrimidines as CDC25B phosphatase inhibitors［J］．Chem Med Chem，2009，4(4) :633－648．

［7］Vujasinovic I，Paravic-Radiĉevic A，Mlinaric-Majerski K，et al．Synthesis and biological validation of novel pyrazole derivatives with anticancer activity guided by 3D-QSAR analysis［J］．Bioorg Med Chem，2012，6(20) : 2101－2110．

［8］Xu L L，Zheng C J，Sun L P，et al．Synthesis of novel 1，3-diaryl pyrazole derivatives bearing rhodanine-3-fatty acid moieties as potential antibacterial agents［J］．Eur J Med Chem，2012，48:174－178．

［9］Chavan H V，Bandgar B P，Adsul L K，et al．Design，synthesis，characterization and anti-inflammatory evaluation of novel pyrazole amalgamated flavones［J］．Bioorg Med Chem Lett，2013，23(5) :1315－1321．

［10］杜海堂，杜海军，欧阳贵平．N-(取代对三氟甲基苯基) -N'-(1，3，5-三取代吡唑-4-羰基)硫脲的合成与生物活性［J］．有机化学，2008，28(2) :356－360．

［11］Solanki M J，Shah V H．Synthesis，antibacterial，and antifungal activities of some novel derivatives of thiazolo［2，3-b］dihydropyrimidine possessing 4-pyrazolyl moiety［J］．Asian J Chem，2012，24(7) :2972－2974．

·研究论文·

Synthesis and Anticancer Activities of Novel Thiazolo［3，2-a］pyrimidine Derivatives Containing Pyrazole Group

WANG Jing1，LIN Ya1，ZHU Xin-ling1，NIE Jing1，ZHANG Lei1，YAO Qi-zheng2
(1．School of Pharmacy，Zunyi Medical College，Zunyi 563003，China; 2．School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:4-(5-Chloro-3-methyl-1-phenyl-4-pyrazolyl) -3，4-dihydronpyrimidin-2 (1H) -(thio) one (3) was prepared by Vilsmeier－Haack and Biginelli reaction using 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one as the raw materials．Five novel thiazolo［3，2-a］pyrimidine derivatives containing pyrazole group (5a～5e) were synthesized by Knoevenagel reactions of 3 with arylaldehyde．The structures were characterized by1H NMR，13C NMR，IR and ESI-MS．The preliminary in vitro anticancer activities of 5a～5e against human prostate cancer PC-3 cells were tested by MTT assay．The results showed that 5a～5e exhibited certain anticancer activities and 2-【4-{［6-(ethoxycarbonyl) -5-(5-chloro-3-methyl-1-phenyl-4-pyrazolyl) -3-oxo-7-methyl-thiazolo［3，2-a］pyrimidin-2 (5H)-ylidene］methyl} phenoxy】acetic acid(5a) exhibited the strongest anticancer activities with IC50of 44．45 μM．

Keywords:thiazolo［3，2-a］pyrimidine; pyrazole; synthesis; anticancer activity

作者简介:王京(1988－)，女，汉族，贵州遵义人，硕士，主要从事抗肿瘤新药分子的设计与合成研究。E-mail: wangjing@ zmc．edu．cn

基金项目:贵州省科技厅项目{黔科合LH字［2014］7565号，黔科合LH字［2014］7557号，黔科合人才团队［2014］4002号} ;贵州省教育厅项目{黔科合人才团队字［2012］03号} ;遵义医学院博士科研启动基金资助项目(F-631)

*收稿日期:2014-08-27;

修订日期:2015-03-13

中图分类号:O626．2; O621．3

文献标识码:A

DOI:10．15952/j．cnki．cjsc．1005－1511．2015．07．0580

通信联系人:张磊，博士，Tel．0851-28609461，E-mail: lei_chang@ yeah．net